朱磊 顧一帆 康金平 韓士鼎 徐寰 周正新

(安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨傷科，安徽 合肥 230001)

老年人出現(xiàn)股骨頭壞死主要包括創(chuàng)傷性或非創(chuàng)傷性，其中非創(chuàng)傷性股骨頭壞死所占比例超過80%〔1〕。非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的病理機制復雜，多數(shù)研究者認為股骨頭內缺血是其主要病理基礎，骨微血管內皮損傷可能是缺血的主要原因，但具體分子機制尚未明確〔2〕。Ras相關蛋白(Rap)1是具有多種生物學功能的Ras家族小分子G蛋白，與細胞遷移能力密切相關〔3〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，脂質過氧化損傷內皮細胞后，細胞中的Rap1能夠提升微血管通透性，降低血管高滲透，減輕組織缺血〔4〕。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶 B(Akt)信號通路是Rap1、血管內皮生長因子(VEGF)的共同下游因子，可能共同調節(jié)股骨頭局部血流狀態(tài)〔5〕。本研究探討了老年非創(chuàng)傷性股骨頭壞死組織中Rap1-PI3K/Akt信號通路表達特點及作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年4月至2020年7月安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院收治的老年非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者50例為非創(chuàng)傷性股骨頭壞死組，男29例，女21例；年齡60～75歲，平均(67.29±5.30)歲；國際骨微循環(huán)研究協(xié)會(ARCO)分期：Ⅲb期15例，Ⅳ期18例，Ⅴ期17例。另收集同期老年創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者50例為創(chuàng)傷性股骨頭壞死組，男27例，女23例；年齡60～76歲，平均(67.90±4.61)歲；ARCO分期：Ⅲb期14例，Ⅳ期16例，Ⅴ期20例。性別、年齡、ARCO分期在兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性?；颊呔现袊t(yī)師協(xié)會2016年頒布的成人股骨頭壞死臨床診療指南中對股骨頭壞死的診斷標準，接受手術治療；未合并關節(jié)感染、糖尿病、全身系統(tǒng)性疾病；本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑和儀器 鼠抗人Rap1、PI3K、Akt單克隆抗體，鼠抗人VEGF多克隆抗體均購于北京達科為生物技術有限公司；鼠抗人GAPDH多克隆抗體購于北京諾博萊德科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG購于北京沃卡威生物技術有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒購于上海聯(lián)邁生物工程有限公司；PCR儀購于杭州瑞誠儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1標本取材 非創(chuàng)傷性股骨頭壞死組取兩個區(qū)域(壞死區(qū)、正常區(qū))骨組織樣本，創(chuàng)傷性股骨頭壞死組取正常區(qū)域骨組織標本。生理鹽水將骨組織標本洗滌干凈后用手術剪刀剪碎，一部分組織用于蘇木精-伊紅(HE)染色和免疫組化染色，另一部分組織在液氮中研磨成粉狀，分為2份，分別用于實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和Western印跡檢測。

1.3.2HE和免疫組化染色 使用4%的多聚甲醛固定組織標本24 h，20%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液(pH7.2)處理，隔日換液到能夠切片為止，4 μm連續(xù)切片。進行HE染色和Rap1、VEGF、PI3K、Akt免疫組化染色。其中免疫組化染色使用鼠抗人Rap1、PI3K、Akt單克隆抗體及鼠抗人VEGF多克隆抗體為一抗，均為1∶300稀釋；辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG為二抗，1∶500稀釋。HE染色結果在100倍光學顯微鏡下觀察，免疫組化染色在200倍光學顯微鏡下觀察。結果判定：無著色(-)、淡黃色(+)、黃色或棕黃色()、棕褐色()。

1.3.3qRT-PCR檢測Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA表達 氯仿和異丙醇提取骨粉中的總RNA，使用核算定量儀測定濃度、純度，取其中1 μg RNA逆轉錄為cDNA。由上海聯(lián)邁生物工程有限公司中國設計并合成Rap1、VEGF、PI3K、Akt基因上下游引物，GAPDH為內參基因。Rap1上游引物：5′-CATATTTAGGGAGTAACGACA-3′，下游：5′-CATCCCTTCCTTTGTCCAGTG-3′。VEGF上游引物：5′-TCGTTACAGGACTTGCAGGG-3′，下游：5′-AGTGGACGAAGACGTCTAAC-3′。PI3K上游引物：5′-GTTACTCCGGTCTCGCTAGA-3′，下游：5′-CTACGGGAAGACTTGACCGT-3′。Akt上游引物：5′-GTTACTCCGGTCTCGCTAGA-3′，下游：5′-CTACGGGAAGACTTGACCGC-3′。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游引物：5′-AAGTAACACGACCCACGGT-3′，下游：5′-ACGAGATCCGCTGATACTGAATC-3′。按照產品說明書配制PCR液體20 μl，擴增條件：94℃預變性30 s，95℃變性5 s，50℃復性30 s，共40個循環(huán)。檢測目標基因相對表達量。

1.3.4Western印跡檢測Rap1、VEGF、PI3K、Akt蛋白表達 預冷的細胞蛋白裂解液在冰上充分理解骨粉30 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至新離心管，BCA法蛋白定量，之后進行蛋白變性處理。配制10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，按照每孔蛋白30 μg上樣后進行SDS-PAGE，將分離出的蛋白電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下封閉、洗膜，加入鼠抗人Rap1、PI3K、Akt單克隆抗體，均為1∶1 000稀釋，鼠抗人VEGF多克隆抗體(1∶500稀釋)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記二抗(1∶5 000稀釋)，室溫搖床孵育2 h，化學放光法成像，使用Image進行灰度分析。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計學軟件進行方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1老年非創(chuàng)傷性股骨頭壞死與創(chuàng)傷性股骨頭壞死不同區(qū)域HE染色 非創(chuàng)傷性股骨頭壞死區(qū)域軟骨細胞數(shù)量明顯減少，軟骨下骨小梁增厚、斷裂，細胞核消失，出現(xiàn)軟骨陷窩，周圍新生毛細血管和纖維母細胞等肉芽組織長入壞死組織，出現(xiàn)肉芽組織增生。非創(chuàng)傷性股骨頭和創(chuàng)傷性股骨頭壞死組骨組織正常區(qū)軟骨細胞未發(fā)生明顯病理學改變。見圖1。

圖1 非創(chuàng)傷性股骨頭壞死與創(chuàng)傷性股骨頭壞死組組織(HE染色，×100)

2.2Rap1、VEGF、PI3K、Akt表達的免疫組化 Rap1、VEGF、PI3K、Akt在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死組組織壞死區(qū)域、非創(chuàng)傷性股骨頭壞死組組織正常區(qū)域、創(chuàng)傷性股骨頭壞死組組織正常區(qū)域均呈陽性表達，其中非創(chuàng)傷性股骨頭壞死組組織壞死區(qū)域Rap1、VEGF、PI3K、Akt表達強度()弱于非創(chuàng)傷性股骨頭組患者組織正常區(qū)域()、創(chuàng)傷性股骨頭壞死組組織正常區(qū)域()，而非創(chuàng)傷性股骨頭壞死組組織正常區(qū)域、創(chuàng)傷性股骨頭壞死組組織正常區(qū)域的Rap1、VEGF、PI3K、Akt表達強度相似。見圖2。

圖2 老年非創(chuàng)傷性股骨頭壞死與創(chuàng)傷性股骨頭壞死不同區(qū)域Rap1、VEGF、PI3K、Akt表達(免疫組化，×200)

2.3Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA和蛋白表達 非創(chuàng)傷性股骨頭壞死組骨組織壞死區(qū)的Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA和蛋白表達水平明顯低于非創(chuàng)傷性股骨頭壞死組骨組織正常區(qū)、創(chuàng)傷性股骨頭壞死組骨組織正常區(qū)(P<0.05)；Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA和蛋白表達水平在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死組骨組織正常區(qū)與創(chuàng)傷性股骨頭壞死組骨組織正常區(qū)之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1和圖3。

表1 兩組不同骨組織取材區(qū)域Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA和蛋白表達水平比較

1～3：非創(chuàng)傷性股骨頭壞死組壞死區(qū)域、非創(chuàng)傷性股骨頭壞死組正常區(qū)域、創(chuàng)傷性股骨頭壞死組正常區(qū)域圖3 Western印跡檢測各組不同骨組織取材區(qū)域Rap1、VEGF、PI3K、Akt蛋白表達

3 討 論

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)病機制目前仍未完全闡明，可能與骨髓微血管內皮細胞和骨細胞損傷，引發(fā)骨細胞、骨組織壞死有關〔6〕。人體股骨頭組織中的血液供應主要由股深動脈及其分支承擔，提供所需的營養(yǎng)成分〔7〕。股深動脈的走行結構為上下支持帶垂直穿入股骨頭內部，該特殊角度容易導致血流中斷，當血管內皮受到侵襲后會激活血管中的凝血機制，加速血栓形成〔8〕。股骨頭組織血管中血栓形成與血管內皮損傷明顯相關，其中非創(chuàng)傷性股骨頭壞死與直接損傷骨髓微血管內皮細胞有關〔9〕。作為內皮細胞特異性的有絲分裂原，VEGF在新生血管形成中發(fā)揮重要作用。VEGF參與調控低氧誘導因子-1、PI3K/Akt等多個信號通路，而上述信號通路均與缺血缺氧所致的股骨頭壞死有關〔10〕。進一步研究發(fā)現(xiàn)，血管內皮損傷后纖維蛋白大量進入血液，凝血系統(tǒng)被激活，出現(xiàn)血栓，引發(fā)股骨頭缺血性壞死〔11〕。目前老年非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者股骨頭微血管內皮受損后難以修復的問題仍困擾臨床。

研究者對Rap1在腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲中作用的研究為解決非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者股骨頭微血管內皮修復問題提供了思路〔12〕。Rasa3能夠調控血管內皮的完整性、黏附性，當Rasa3消耗完后會減少黏附物質的周轉，黏附物質主要以血管內皮細胞鈣黏連蛋白為基礎，降低內皮細胞間的黏附能力〔13〕。Rap1還能夠使VEGF相關的內皮細胞通透性增加，在內皮屏障動態(tài)調節(jié)中發(fā)揮重要作用〔14〕。因此，可推測Rap1水平下降后無法及時有效地修復股骨頭中的受損血管內皮，造成血栓持續(xù)處于高水平，引發(fā)股骨頭壞死。

本研究說明非創(chuàng)傷性股骨頭壞死區(qū)域血管內皮受損，且無法得到有效修復。Rap1、VEGF、PI3K、Akt低表達可能參與了老年非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)生與發(fā)展。本文提示股骨頭壞死部位Rap1合成量減少，無法有效修復股骨頭中受損的血管內皮，造成VEGF合成、分泌量下降，抑制了新生血管形成，進一步加重了血管內皮損傷。同時Rap1、VEGF低表達也會降低內皮細胞的黏附、遷移能力，老年非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)生與發(fā)展可能與內皮細胞的黏附、遷移能力下降有關。

PI3K/Akt信號通路是人體細胞中激活頻率最高的通路之一，也是Rap1、VEGF的共同下游因子，在細胞凋亡、骨代謝、血管新生等生理過程中發(fā)揮重要作用〔15〕。Akt磷酸化后激活下游內皮型一氧化氮合成酶，增加重組人PIM-1蛋白表達，促進一氧化氮分泌，達到局部血管擴張作用〔16〕。目前Rap1-PI3K/Akt信號通路在股骨頭壞死中的作用仍缺少相關研究報道，非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)生可能與該信號通路密切相關。綜上，Rap1-PI3K/Akt信號通路激活受限導致了老年非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)生與發(fā)展。