馬昕悅，劉鳴雨，李 熔，薛 勇,

（1.國家糧食產業(yè)（青稞深加工）技術創(chuàng)新中心，中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.國家果蔬工程技術加工中心，中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，由胰島素分泌缺陷或其作用受損，或兩者兼有引起。2019年全球約有4.63億糖尿病人，其中90%為2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）[1]。T2DM 在中國的發(fā)病率較高[2]，已成為我國主要的公共衛(wèi)生問題之一。糖尿病會引起許多并發(fā)癥，如引發(fā)各種感染，誘發(fā)多器官功能障礙綜合征[3]、脊髓損傷[4]，還會引起脂代謝紊亂，增加腦卒中[5]、眼底視網膜病變[6]的風險。此外，T2DM還會造成抑郁、焦慮等心理疾病[7]。然而糖尿病暫無根治方法，患者需通過長期服藥來控制[8]。近年來隨著食源性功能肽輔助治療慢性病的逐漸興起，大量研究發(fā)現動物食品中廣泛存在降糖肽，這些肽未來可能用于糖尿病的輔助治療?；诖耍疚膶游镌葱越堤请牡默F有成果進行綜述，為預防和輔助治療糖尿病及相關功能性食品的開發(fā)提供理論依據。

1 食源性降糖肽

1.1 食源性降糖肽靶點

降糖肽主要的作用機理是抑制糖代謝過程中的關鍵酶，其中α-葡萄糖苷酶和DPP-4一直是關注的焦點。食源性活性肽主要通過氫鍵、極性和疏水性作用，與酶催化位點上的氨基酸結合，從而產生競爭性抑制。α-葡萄糖苷酶可將食物中的大分子碳水化合物分解成單糖，單糖會進入血液使血糖升高，故α-葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制相應酶的活性，延緩碳水化合物吸收，繼而減少葡萄糖的產生，達到降低餐后血糖的目的[9]。此外，腸促胰素分為胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素分泌多肽（glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP），兩者均能作用于胰島β細胞，促進胰島素分泌、胰島β細胞再生和增殖[10]。而GLP-1會快速被機體中廣泛存在的DPP-4降解，半衰期僅為2 min[11]。因此，抑制DPP-4的活性可延緩GLP-1的降解，繼而改善胰島功能。對DPP-4的抑制主要通過活性肽與其催化活性位點D192、E192和R253結合，使酶結構發(fā)生改變，無法作用于GIP和GLP-1的二肽尾，從而提高內源性GLP-1和GIP水平，最終達到降低血糖的效果[9]。

1.2 食源性肽制備方法

食源性降糖肽的制備方法有酶解法、微生物發(fā)酵法和人工合成法[12]，其中酶解法應用最為廣泛。酶的專一性強，故水解時應注意選擇適當種類的酶，一般選擇一種酶進行水解或多種酶復合水解。常用的有中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶等。此外，酶活性受環(huán)境條件影響較大，若要達到最佳的酶解效果，需將溫度和pH控制為最適條件。其他反應條件如底物濃度、酶濃度、酶解時間、超聲輔助提取時間等會對多肽得率產生影響，由于酶解對象不同，這些條件的最佳值需要通過實驗優(yōu)化得到。酶解過程中蛋白質水解為短肽鏈，消化率提高，從而最大程度地保留食品的營養(yǎng)價值，同時，酶解法具有反應條件溫和、無不良副反應、反應進程易控制等優(yōu)點[13]，故該方法在食源性肽的工業(yè)化生產中有良好應用前景。

1.3 食源性肽降糖效果評價方法

評價食源性降糖肽降糖效果的常用方法有體外驗證、體內驗證和分子對接等。體外驗證一般選用α-葡萄糖苷酶、DPP-4試劑盒[14]。試劑盒工作原理多遵循酶聯免疫吸附測定法。微孔板上包被著純化的抗體，樣品被加入微孔后，與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（3,3',5,5',-tetramethylbenzidine，TMB）顯色。TMB在HRP的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成黃色，顏色的深淺和樣品濃度呈正相關，根據試劑盒檢測結果可判斷樣品的降糖效果[15]。

體內驗證是以糖尿病大鼠、小鼠或者人為研究對象，采用口服給藥的方法，檢驗降糖肽的有效性[16-17]。動物實驗一般先建立糖尿病小鼠模型，經過一定時間的灌胃給藥后，取血清對血糖、糖化血紅蛋白、胰島素、C肽等指標進行檢測[14]。人群研究通常招募糖尿病患者并將其隨機分組，分別給予降糖肽和安慰劑，對比不同組糖代謝指標的差異。例如，有研究探究海洋魚膠原蛋白肽（marine collagen peptides，MCPs）對2型糖尿病患者的治療效果，實驗招募了100名糖尿病患者，他們被隨機分為治療組和對照組。治療組連續(xù)3個月每天額外服用13 g MCPs，安慰劑組不服用。在治療前、治療后1.5和3個月采集血樣，結果顯示，治療組患者的空腹血糖、糖化血紅蛋白、空腹胰島素等指標均有明顯改善，說明了MCPs有利于調節(jié)糖尿病患者的糖代謝[18]。

分子對接技術篩選速度快，精度高，常用于降糖藥物的篩選。分子對接方法可以從天然產物小分子化合物庫中自動篩選出與靶標蛋白高度結合的天然小分子[19]。例如，在研究生物活性肽與α-葡萄糖苷酶之間的結合方式時，從RCSB Protein Data Bank數據庫下載α-葡萄糖苷酶三維結構文件，利用Discovery Studio軟件包繪制多肽的三維結構，并對多肽進行能量最小化處理。然后利用Discovery Studio軟件處理α-葡萄糖苷酶分子，去除所有水分子，并給酶分子加氫。處理后的α-葡萄糖苷酶分子分別與多肽進行分子對接，從而篩選出結合效果好的肽，即為潛在的抑制肽[20]。

2 動物源性降糖肽

2.1 來源于畜禽肉的降糖肽

畜禽肉是優(yōu)質的動物性蛋白，其中豬肉和雞肉蛋白是降糖肽的潛在來源。K?ska等[21]通過胃腸道酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶）水解豬肉蛋白，并對釋放的短肽進行分析，發(fā)現所得序列以二肽為主，其中GF、MW、MF、PF、PW活性指數最高，表明F和W兩個疏水芳香氨基酸在抑制DPP-4活性上起著重要作用。已有資料表明，在食物蛋白衍生出的短肽中，二肽對DPP-4的抑制作用比三肽或氨基酸更明顯[22]。本研究的結果支持二肽對DPP-4抑制作用較強，同時研究要重點關注水解產物中含F或W的二肽。機體胃腸道環(huán)境比較復雜，體外實驗的結果并不能簡單推及到體內。Sim等[23]給2型糖尿病KKAy小鼠和GK大鼠口服了一種以蛋白質和肽為主要成分的液態(tài)商業(yè)雞肉提取物。8周后測定發(fā)現，糖尿病動物的血糖水平顯著降低，而血液胰島素水平沒有明顯變化，進一步分子層面的結果發(fā)現細胞質膜葡萄糖轉運蛋白-4（GLUT4）和胞漿酪氨酸磷酸化的胰島素受體底物-1（IRS-1）顯著增加。可見雞肉提取物雖然不能改變胰島素的分泌情況，但能有效減輕胰島素抵抗，對2型糖尿病有良好的控制作用。目前從畜禽肉中水解得到降糖肽的研究相對有限，這些水解肽在體內的穩(wěn)定性和降糖效果有待于進一步研究。

2.2 來源于魚類的降糖肽

魚類是人體獲取動物性蛋白的主要來源之一，流行病學調查資料顯示，適量攝入魚類能有效控制餐后血糖，降低罹患糖尿病的風險，魚類蛋白經消化產生的水解肽可能是發(fā)揮降糖作用的物質之一[24]。

近年來，魚肉中的降糖肽逐漸被發(fā)掘，其中鱒魚、鱸魚、鰱魚、鮭魚、方鯛、大比目魚、羅非魚等普遍存在降糖肽。Ketnawa等[25]用堿性蛋白酶水解鱒魚骨架并對蛋白水解物進行體外測定，發(fā)現水解物對DPP-4的抑制活性為40.45%±0.48%，IC50為4.80±0.60 mg/mL。研究還發(fā)現，低分子量肽段比例增加會導致更高的DPP-4抑制活性，可見多肽分子量大小和DPP-4有關，但作者并未對具體多肽對DPP-4的抑制機制進行進一步探究。Wang等[26]將大口黑鱸蛋白模擬胃腸水解，構建水解多肽數據庫，進一步采用分子對接技術篩選和DPP-4結合能力最強的肽段。結果發(fā)現6種三肽對DPP-4表現較強的抑制活性，其中ICY活性最強（IC50=0.73 mmol/L），它能與DPP-4之間形成氫鍵、π鍵和靜電相互作用，并在DPP-4高度疏水的S1位點形成疏水相互作用。分子對接技術的引入，除了能明確多肽和關鍵蛋白的結合能力，還能進一步預測結合位點和機理，同時能夠明確發(fā)揮關鍵作用的結構特征。Zhang等[27]借助生物信息學技術，鑒定、分離、合成了鰱魚蛋白水解產物中有效的DPP-4抑制肽。其中中性蛋白酶產生的水解產物具有最大的DPP-4抑制作用（IC50=1.12 mg/mL），鑒定出的四種DPP-4抑制肽分別為AGPPGPSG、APGPAGP、LPIIDI和ALAPSTM。以往研究表明，肽抑制劑N端三肽序列決定其與DPP-4的結合，而P位于2位的序列由于其底物樣結構，通常是DPP-4的競爭性抑制劑[28-29]。對本研究鑒定出的降糖肽的體外實驗表明，P位于第二位的LPIIDI和APGPAGP有更高的DPP-4抑制活性，IC50分別為105.44和229.14 μmol/L，結果與既往報道相符。若某些氨基酸具有特定的活性，則含有此類殘基的短肽也可能具有類似的作用，比如GP和Q能夠有效促進GLP-1分泌[30]，VLGP也被證實具有 DPP-4抑制活性[31]。Harnedy等[32]使用堿性蛋白酶和風味蛋白酶酶解鮭魚明膠，其中AVLGPK和AVLGPQ中均含有VLGP的序列，體外實驗表明二者均能抑制DPP-4活性。

以上研究表明魚類的蛋白水解產物在生物體外具有良好的降糖效果，然而生物體內不同的環(huán)境會影響降糖肽的作用方式，可能導致降糖效果的改變，因此有必要進行細胞實驗或動物實驗的進一步驗證。Harnedy等[33]用堿性蛋白酶和風味蛋白酶水解方鯛蛋白，從水解物中鑒定出了22條DPP-4抑制肽和15條促胰島素肽，進一步通過體外實驗和細胞實驗對其評估。其中DPP-4抑制肽IPVDM在體外常規(guī)實驗中 IC50為 21.72±1.08 μmol/L，在 Caco-2 細胞實驗中 IC50為 44.26±0.65 μmol/L，均顯示出較強的DPP-4抑制活性，說明該降糖肽在細胞內確實能夠發(fā)揮抑制作用。此外，還發(fā)現IPVDM可刺激胰腺BRIN-BD11細胞的胰島素分泌活性。綜上可知，IPVDM能以完整的形式穿越人上皮細胞膜，并通過多種機制介導降糖作用。多肽在胃腸道系統(tǒng)里面可能會進一步分解，細胞試驗的結果并不能簡單推及到體內。Wang等[34]對大比目魚皮膚水解液和羅非魚皮膚明膠水解液進行體外DPP-4抑制活性和大鼠體內抗高血糖效果的研究，發(fā)現兩種水解液均具有較好的降糖活性，大鼠DPP-4的活性顯著降低，GLP-1的分泌明顯增加，說明該蛋白水解肽在體內仍能發(fā)揮明顯的DPP-4抑制效果。有研究進一步采用人群干預實驗探究鱈魚蛋白水解物的降糖效果，結果發(fā)現最高劑量的水解物與低劑量的相比，具有更好的降低餐后血糖水平的效果[35]。目前關于魚肉降糖肽的研究是熱點，但是多半停留在體外實驗的階段，在體內能否繼續(xù)發(fā)揮降糖作用是限制其應用和推廣的關鍵因素。另外，目前關于魚肉降糖肽通過抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性來發(fā)揮降糖作用的研究較少。

2.3 來源于血液的降糖肽

動物血液是畜禽屠宰加工過程中的主要副產品，目前未能被充分利用，浪費較為嚴重。動物血液中含有豐富的蛋白質和其他營養(yǎng)素，已有的研究表明駝血、豬血、牛血可作為降糖肽的開發(fā)來源。劉麗君[36]利用酶解法制備駝血多肽，結果表明風味蛋白酶酶解4 h，酶濃度為5 mg/100 mg，料液比為1:6時，駝血酶解產物的α-淀粉酶抑制活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性最高。進一步分離純化發(fā)現多肽YPGETR的α-淀粉酶抑制率最高（66.03%），YPWTRR 的α-葡萄糖苷酶抑制率最高（90.86%），說明駝血多肽具有潛在降糖作用。Lafarga等[37]利用PeptideCutter軟件對豬和牛血液中已知序列的蛋白成分進行模擬酶切，在豬和牛血清白蛋白中得到了一種新的DPP-4抑制肽PPL，體外實驗表明其IC50為390.14±44.3 μmol/L。此外，在牛血紅蛋白亞基α中還鑒定出了多種DPP-4抑制肽 VA、KA、LA、FP、PA、LP、LL、HA，這些肽此前已被證明具有降糖活性。計算機模擬酶切避免了傳統(tǒng)酶解費時且易受環(huán)境干擾的缺陷，能高效地鑒定并獲得降糖肽序列，這為降糖肽的開發(fā)提供了新方法，但這些肽必須在特定的位點被酶切下，才能正常發(fā)揮降糖活性，目前的酶解工藝還難以實現精準。

2.4 來源于乳類的降糖肽

乳類是一種營養(yǎng)品質高的蛋白質，在乳中提取降糖肽作為功能性食品成分，是當前的研究熱點之一。諸多研究表明，駱駝乳、牛乳、羊乳等乳類均具有降糖作用。Korish等[38]給鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠持續(xù)口服駱駝乳或牛乳，干預8周后二者均可使糖尿病大鼠體重增加，血糖水平下降，葡萄糖耐受性改善?？梢婑橊勅楹团Ｈ榻浵好附夂蟮漠a物很可能含有降糖活性肽。Nongonierma等[39]研究了駱駝乳蛋白的水解物，在水解產物中檢測到來自于α-乳清蛋白的DPP-4抑制肽LAHKPL和ILDKEGIDY，以及來自于β-酪蛋白的DPP-4抑制肽VPV、YPI和 VPF，三者的IC50值分別為 6.6±0.5、35.0±2.0、55.1±5.8 μmol/L，表明駱駝乳中確實含有降糖肽。此外，駱駝乳中分離出的VPV是迄今為止發(fā)現的第二強DPP-4抑制肽，僅次于抑二肽素A，這提示駱駝乳可能具有良好的降糖作用。牛乳中的乳清中富含α-乳白蛋白，甲承立[40]對α-乳白蛋白水解產物進行研究，發(fā)現從水解物中分離出的活性肽LDQWLCEKL具有較高的DPP-4抑制活性，IC50為131.07 μmol/L，并能促進GLP-1的分泌和表達，可見牛乳也能水解產生降糖肽。羊乳作為生活中常見的乳類之一，逐漸引起研究者的關注。Jan等[41]使用胰蛋白酶、胃蛋白酶和糜蛋白酶水解生羊奶和煮羊奶中的酪蛋白，并對水解產物進行α-淀粉酶抑制實驗。結果顯示，與煮沸羊乳酪蛋白水解物相比，不同酶解方式下生羊乳酪蛋白水解物對α-淀粉酶抑制效果均較強，提示食物熱處理引起的蛋白變性可能會影響到其水解多肽的功能。

2.5 來源于蛋類的降糖肽

蛋類也是日常生活中蛋白質的主要來源，研究者對其降糖肽的研究主要集中于對不同部位蛋白的降糖效果進行評價。Yu等[42]使用堿性蛋白酶對蛋清蛋白進行酶解，并測定產物中多肽的抑制活性，體外實驗發(fā)現RVPSLM、TPSPR、DLQGK、AGLAPY、RVPSL、DHPFLF、HAEIN、QIGLFα-葡萄糖苷酶抑制活性較強。其中，RVPSLM和TPSPR活性較高，IC50值分別為23.07和40.02 μmol/L。Zambrowicz等[43]用亞洲南瓜蛋白酶制備蛋黃蛋白副產物水解液，發(fā)現LAPSLPGKPKPD具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制作用。Zambrowicz等[44]使用胃蛋白酶水解蛋黃蛋白，發(fā)現多肽YINQMPQKSRE、YINQMPQKSREA、VTGRFAGHPAAQ兼有抑制α-葡萄糖苷酶和DPP-4的效果，可見卵黃蛋白也可能是降糖肽的來源之一。綜上可知，蛋清和蛋黃蛋白中均可制備降糖肽，但是目前的研究并未深入解析潛在降糖肽和α-葡萄糖苷酶、DPP-4分子作用機制，更未評價其在體內降糖效果。蛋類相對于其他動物性食物蛋白，相對便宜、易得，深入解析降糖作用機理和明確體內降糖效果，有助于基于蛋類的功能性食品的開發(fā)。

2.6 來源于其他動物性食物的降糖肽

動物源食物較為豐富，除了常見的畜禽、魚類、蛋類及其制品，蛋白質含量豐富的海產品如蝦、海參等也是研究降糖肽的熱點。Ji等[45]對南極磷蝦蛋白水解物的DPP-4體外抑制活性進行了評估，發(fā)現KVEPLP和PAL具有對DPP-4的抑制活性，IC50分別為 0.73±0.04 和 0.88±0.03 mg/mL，表明南極磷蝦蛋白水解物具有降糖的潛力。王美華等[46]研究了海參肽對正常小鼠糖耐量水平的影響，以及對皮下注射腎上腺素所致應激性高血糖模型小鼠血糖水平的調節(jié)作用。與模型組相比，海參肽能顯著降低正常小鼠糖耐量試驗中的血糖值，并能顯著降低腎上腺素所致高血糖小鼠的血糖值。此外，我國有傳統(tǒng)食用習慣的動物性食物如蠶蛹、蜂王漿、馬鹿茸，也被證實具有良好的降糖效果。張玉等[47]使用酸性蛋白酶酶解蠶蛹蛋白粉，并研究不同劑量蠶蛹蛋白酶解肽對糖尿病小鼠的影響。連續(xù)給藥5周后，發(fā)現蠶蛹蛋白酶解肽可明顯降低小鼠糖化血清蛋白含量，改善糖尿病小鼠的心臟指數、腎臟指數和肝臟指數。朱作藝等[48]以酸性蛋白酶水解蜂王漿粗蛋白，測定結果顯示蜂王漿蛋白肽對α-葡萄糖苷酶的IC50為6.94 mg/mL，說明蜂王漿蛋白肽具有一定的降糖活性。包美麗[49]采用雙酶法（堿性蛋白酶和風味蛋白酶）以馬鹿茸為原料制備降血糖肽。當水解終產物質量濃度為3 mg/mL時，α-葡萄糖苷酶抑制率可達94.09%，IC50為1.82 mg/mL。以上研究表明降糖肽也可能廣泛存在于這些動物性食品中，研究中不僅要關注主要動物性食物，傳統(tǒng)功能性食材也值得探討研究。文中涉及到的動物源性降糖肽總結如表1。

表1 動物源性降糖肽Table 1 Animal-derived hypoglycemic peptides

3 結論與展望

隨著營養(yǎng)與健康的觀念逐漸深入人心，消費者越來越認同這樣一個觀點：食物不僅提供營養(yǎng)，同時也提供許多有益身體健康的功能成分。許多研究者已從體外測定、生物信息學技術、細胞實驗、動物實驗等多個方面證實了動物食品中廣泛存在降糖活性肽，說明動物源性降糖肽具有很大的研究價值。目前，血液源降糖肽的數據較少，說明血液源降糖肽可能還處在未被充分開發(fā)的階段，值得持續(xù)關注。來源于中國傳統(tǒng)食品的降糖肽為商業(yè)化產品的開發(fā)提供了一條新思路：我國糖尿病患者數量大，傳統(tǒng)食品又有著長久以來的食用基礎，若能成功開發(fā)降糖功能食品，相較于其他動物源產品將更易被消費者接受，有著巨大的商業(yè)潛力。魚類和乳類是當下降糖肽來源的研究熱點，其中許多降糖肽的序列已經被鑒定出來，作用機制也逐步明晰，對于這些來源的降糖肽，應重點關注這些肽在人體內是否仍能保持原有的降糖活性，以及如何強化降糖肽在人體內的功效。在目前動物源性降糖肽的研究中，最明顯的不足是人體試驗數據較為匱乏，且部分研究發(fā)現人群直接食用含降糖肽的動物食品并不能有效地降低血糖，這可能是因為動物蛋白在體外與體內消化的環(huán)境與方式存在較大差異。因此，在開發(fā)動物源降糖肽的同時，也需要考慮如何使這些降糖肽更高效地在人體內發(fā)揮作用，并對患者癥狀起到明顯的改善作用，這對動物源降糖肽成功實現商業(yè)化以及有效輔助治療糖尿病有著重要意義。