林東文, 王寶琴,張 艷,劉 博,王文秀,*

(1.福建省龍巖市新羅區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,福建 龍巖 364000; 2.濱州學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院, 山東 濱州 256600;3.海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海南 ?？?571100; 4.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東 濱州 256600)

豬偽狂犬病(pseudorabies，PR)是由豬偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的一種急性、熱性、敗血性傳染病[1-2]，自2011年以來(lái)，PRV變異毒株的流行增加了該病的綜合防控難度[3-5]，PRV將成為未來(lái)一段時(shí)間內(nèi)對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展危害最為嚴(yán)重的傳染病之一。PRV屬皰疹病毒科(Herpesvifidae)α-皰疹病毒亞科(Alpha-herpesvirinae)，病毒基因組全長(zhǎng)約150 kb，大約編碼50余種結(jié)構(gòu)蛋白[6-7]。其中g(shù)E基因是病毒復(fù)制非必需基因，由gE基因編碼的gE蛋白是病毒的非必需糖蛋白，gE基因的缺失并不影響病毒的免疫原性，但可以大大降低病毒的毒力。因此，gE基因成為PRV基因缺失疫苗研究的首選基因[8-11]。gD基因是病毒復(fù)制必需基因，該基因編碼的gD蛋白不僅在病毒吸附和侵入過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而且也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的必需糖蛋白，gD蛋白成為亞單位疫苗和診斷抗原研究的首選蛋白[12-17]。目前，在PRV預(yù)防方面，由于gE基因缺失疫苗免疫的豬群產(chǎn)生gD抗體而不產(chǎn)生gE抗體，而PRV野毒株感染的豬群同時(shí)產(chǎn)生gD抗體和gE抗體,我國(guó)普遍推廣使用PRV gE基因缺失疫苗。因此，同時(shí)檢測(cè)gD抗體和gE抗體即可實(shí)現(xiàn)PRV免疫抗體和野毒抗體的鑒別。鑒于此，本研究利用原核表達(dá)技術(shù)對(duì)PRV的gD蛋白和gE蛋白進(jìn)行了截短表達(dá)，分別以表達(dá)的重組蛋白作為檢測(cè)抗原，建立了gD-間接ELISA檢測(cè)和gE-間接ELISA檢測(cè)方法，兩種檢測(cè)方法的聯(lián)合應(yīng)用將為PRV免疫抗體和野毒抗體的鑒別診斷和PRV凈化提供一種技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 病毒、血清、載體

PRV流行毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；PRV陽(yáng)性血清、PRV疫苗免疫血清、PRV陰性血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)陽(yáng)性血清、豬瘟病毒(CSFV)陽(yáng)性血清、豬細(xì)小病毒(PPV)陽(yáng)性血清、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)陽(yáng)性血清、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)陽(yáng)性血清、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)陽(yáng)性血清、原核表達(dá)載體pET-30a(+)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

2×Premix Taq酶、BamH Ⅰ和HindⅢ內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶，均購(gòu)自TaKaRa公司；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；HRP標(biāo)記兔抗豬IgG，購(gòu)自Abbkine公司；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中登錄的PRV疫苗毒株gD和gE基因序列分別設(shè)計(jì)1對(duì)引物(詳見(jiàn)表1)；

表1 引物序列

1.4gD、gE基因的PCR擴(kuò)增

利用DNA提取試劑盒提取PRV流行毒株的基因組DNA，分別利用gD基因和gE基因擴(kuò)增引物對(duì)DNA進(jìn)行g(shù)D基因和gE基因的PCR擴(kuò)增，gD基因和gE基因PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序均一致，PCR擴(kuò)增體系為：20.0 μL 2×Premix Taq、4 μL DNA、上游和下游引物各1.0 μL、14 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.5 表達(dá)載體的構(gòu)建

將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后，利用BamHⅠ和Hind Ⅲ內(nèi)切酶分別對(duì)gD基因片段、gE基因片段、pET-30a載體進(jìn)行雙酶切。取酶切后的gD基因片段和pET-30a載體片段進(jìn)行連接，gE基因片段和pET-30a載體片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化、增菌、質(zhì)粒抽提、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定后分別構(gòu)建pET-gD、pET-gE重組質(zhì)粒，并將構(gòu)建的pET-gD、pET-gE重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 重組蛋白的表達(dá)與純化

將構(gòu)建的pET-gD、pET-gE重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，利用IPTG對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后收集pET-gD、pET-gE表達(dá)產(chǎn)物，利用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒對(duì)pET-gD、pET-gE表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.7 重組蛋白的Western blot檢測(cè)

在SDS-PAGE各泳道內(nèi)依次加入預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、重組gD蛋白、重組gE蛋白、預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、重組gD蛋白、重組gE蛋白，SDS-PAGE結(jié)束后將其轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)印結(jié)束后將硝酸纖維素膜沿中間剪為大小一致的二部分，將2塊硝酸纖維素膜置于同一個(gè)平皿中，加入5 %脫脂奶粉后于4 ℃封閉過(guò)夜，洗滌后，將2塊硝酸纖維素膜分別置于二個(gè)不同平皿中，一個(gè)平皿加入PRV陽(yáng)性血清(1∶100稀釋)，另一個(gè)平皿加入PRV疫苗免疫血清(1∶100稀釋)，將二個(gè)平皿同時(shí)置于37 ℃孵育1 h，分別洗滌后，將2塊硝酸纖維素膜置于同一個(gè)平皿中，加入HRP標(biāo)記兔抗豬IgG(1∶5 000稀釋)于37 ℃孵育30 min，洗滌后，將2塊硝酸纖維素膜置于二氨基聯(lián)苯胺緩沖溶液(DAB)中顯色。

1.8 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

參照何博等[18]優(yōu)化間接ELISA反應(yīng)條件的方法，分別將重組蛋白(gD蛋白和gE蛋白)的不同包被量和一抗不同稀釋度、不同封閉液和不同作用時(shí)間、酶標(biāo)二抗不同稀釋度和不同作用時(shí)間、一抗不同作用時(shí)間和底物不同作用時(shí)間組成棋盤，采用方陣滴定法確定gD-間接ELISA和gE-間接ELISA的蛋白最佳包被量和一抗最佳稀釋度、最佳封閉液和最佳作用時(shí)間、酶標(biāo)二抗最佳稀釋度和最佳作用時(shí)間、一抗最佳作用時(shí)間和底物最佳作用時(shí)間。

1.9 間接ELISA臨界值的確定

1.10 敏感性試驗(yàn)

利用gD-間接ELISA方法和gE-間接ELISA方法分別對(duì)不同稀釋倍數(shù)的PRV陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，確定gD-間接ELISA方法和gE-間接ELISA方法的敏感性。

1.11 特異性試驗(yàn)

利用gD-間接ELISA方法和gE-間接ELISA方法分別對(duì)PRRSV、CSFV、PPV、PCV-2、PEDV、TGEV陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)立PRV陽(yáng)性血清、PRV疫苗免疫血清、PRV陰性血清對(duì)照，確定gD-間接ELISA方法和gE-間接ELISA方法的特異性。

1.12 重復(fù)性試驗(yàn)

1.12.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 用同一批抗原包被的ELISA板檢測(cè)陽(yáng)性血清和陰性血清各3份，每份血清平行做4孔重復(fù)，分別計(jì)算變異系數(shù)，確定gD-間接ELISA方法和gE-間接ELISA方法的批內(nèi)重復(fù)性。

1.12.2 批間重復(fù)性試驗(yàn) 用4批抗原包被的ELISA板檢測(cè)陽(yáng)性血清和陰性血清各3份，分別計(jì)算變異系數(shù)，確定gD-間接ELISA方法和gE-間接ELISA方法的批間重復(fù)性。

1.13 臨床應(yīng)用 聯(lián)合應(yīng)用gD-間接ELISA方法和gE-間接ELISA方法對(duì)采集的2 156份臨床豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，分析臨床血清樣品的PRV抗體陽(yáng)性率、PRV野毒抗體陽(yáng)性率、PRV免疫抗體陽(yáng)性率。

2 結(jié)果與分析

2.1gD、gE基因PCR擴(kuò)增

如圖1所示，以gD基因、gE基因的擴(kuò)增引物對(duì)PRV流行毒株DNA分別擴(kuò)增出了大小約為666 bp和507 bp的特異性片段，gD基因和gE基因的擴(kuò)增片段大小均與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定結(jié)果

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

如圖2所示，pET-gD、pET-gE重組質(zhì)粒的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切產(chǎn)物分別約為5 900 bp、666 bp和5 900 bp、507 bp的特異性條帶，pET-gD、pET-gE重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物片段大小均與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符。pET-gD重組質(zhì)粒和pET-gE重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果表明插入到表達(dá)載體中的gD基因和gE基因閱讀框架完全正確。

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 重組蛋白的表達(dá)與純化

如圖3所示，pET-gD和pET-gE經(jīng)IPTG誘導(dǎo)均獲得了以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白，重組gD蛋白和重組gE蛋白大小分別約為32 ku和27 ku，其分子質(zhì)量與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符。重組gD蛋白和gE蛋白經(jīng)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化后均獲得了較高純度的蛋白。

圖3 重組蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果

2.4 重組蛋白的Western blot檢測(cè)

如圖4所示，重組gD蛋白、重組gE蛋白均可與PRV陽(yáng)性血清發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，重組gD蛋白可與PRV疫苗免疫血清發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，而重組gE蛋白與PRV疫苗免疫血清未發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，重組gD蛋白和重組gE蛋白均表現(xiàn)出了良好的免疫學(xué)活性。

圖4 重組蛋白的Western blot檢測(cè)

2.5 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

經(jīng)方陣滴定法確定重組gD蛋白和重組gE蛋白的最佳包被量分別為1.35 μg/孔和1.01 μg/孔，一抗最佳稀釋度均為1:50，最佳封閉液均為1%BSA，封閉液最佳作用時(shí)間均為1 h，酶標(biāo)二抗最佳稀釋度均為1:2 000，酶標(biāo)二抗最佳作用時(shí)間均為30 min，一抗最佳作用時(shí)間均為1 h，底物最佳作用時(shí)間均為10 min。

2.6 臨界值的確定

2.7 敏感性試驗(yàn)

如圖5所示，gD-間接ELISA檢測(cè)1:25 600倍稀釋的PRV陽(yáng)性血清的OD450nm值為0.335，gE-間接ELISA檢測(cè)1:12 800倍稀釋的PRV陽(yáng)性血清的OD450nm值為0.318，結(jié)果均為陽(yáng)性，gD-間接ELISA和gE-間接ELISA方法檢測(cè)PRV陽(yáng)性血清的最低檢出效價(jià)分別為1:25 600和1:12 800，gD-間接ELISA和gE-間接ELISA方法均具有良好的敏感性。

圖5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 特異性試驗(yàn)

如表2所示，gD-間接ELISA方法檢測(cè)PRV陽(yáng)性血清和PRV疫苗免疫血清為陽(yáng)性，而檢測(cè)PRRSV、CSFV、PPV、PCV-2、PEDV、TGEV陽(yáng)性血清均為陰性；gE-間接ELISA方法檢測(cè)PRV陽(yáng)性血清為陽(yáng)性，而檢測(cè)PRV疫苗免疫血清和PRRSV、CSFV、PPV、PCV-2、PEDV、TGEV陽(yáng)性血清均為陰性。表明gD-間接ELISA和gE-間接ELISA方法均具有良好的特異性。

表2 特異性試驗(yàn)的OD450nm值

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

如表3所示，gD-間接ELISA方法和gE-間接ELISA方法的批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均小于5%，批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于7%，gD-間接ELISA和gE-間接ELISA方法均具有良好的重復(fù)性。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)

2.10 臨床應(yīng)用

如表4所示，聯(lián)合應(yīng)用gD-間接ELISA方法和gE-間接ELISA方法對(duì)采集的2 156份臨床豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，gD-間接ELISA方法檢測(cè)出陽(yáng)性樣品1 918份，gD抗體陽(yáng)性率為88.96%；gE-間接ELISA方法檢測(cè)出陽(yáng)性樣品87份，gE抗體陽(yáng)性率為4.04%。在gD-間接ELISA方法檢測(cè)為陽(yáng)性的1 918份血清樣品中，共計(jì)有87份樣品經(jīng)gE-間接ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性，即這87份樣品的gD抗體并不是PRV疫苗免疫后的免疫抗體，而是由于感染PRV野毒造成的野毒抗體，故2 156份臨床豬血清樣品的PRV免疫抗體陽(yáng)性份數(shù)應(yīng)為1 831份，PRV免疫抗體陽(yáng)性率為84.93%。

表4 臨床PRV免疫抗體和野毒抗體檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

為逐步實(shí)現(xiàn)我國(guó)PRV的凈化，在PRV gE基因缺失疫苗推廣應(yīng)用的同時(shí)還應(yīng)加強(qiáng)PRV野毒感染的鑒別診斷并及時(shí)淘汰野毒感染豬。因此，建立和推廣應(yīng)用PRV野毒鑒別診斷技術(shù)是PRV gE基因缺失疫苗推廣應(yīng)用和實(shí)現(xiàn)PRV凈化的關(guān)鍵。目前，我國(guó)研究學(xué)者已經(jīng)陸續(xù)建立了針對(duì)PRV gE基因的PCR、熒光定量PCR、LAMP等分子生物學(xué)鑒別檢測(cè)方法[19-21]，但PCR、熒光定量PCR、LAMP等檢測(cè)方法只能特異性的檢測(cè)PRV病原，病原學(xué)檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)處于發(fā)病期的感染豬樣品具有明顯的優(yōu)勢(shì)，由于不同日齡的豬感染PRV后的臨床癥狀存在較大差異[21-22]，仔豬和母豬感染PRV后可表現(xiàn)出顫抖、搔癢、嘔吐、腦脊髓炎和胎兒流產(chǎn)、弱仔、死仔等明顯的臨床癥狀，而育肥豬感染PRV后一般經(jīng)一過(guò)性發(fā)熱后而耐過(guò)，對(duì)于康復(fù)后的育肥豬不一定能夠檢測(cè)到PRV病原[23-24]，同時(shí)，應(yīng)用PCR、熒光定量PCR、LAMP等病原學(xué)方法檢測(cè)育肥豬存在漏檢的可能。血清學(xué)抗體檢測(cè)方法通過(guò)檢測(cè)豬群的PRV gE抗體即可實(shí)現(xiàn)野毒感染的鑒別診斷，該方法對(duì)于檢測(cè)康復(fù)后的育肥豬方面存在明顯的優(yōu)勢(shì)。在本研究中，利用原核表達(dá)技術(shù)分別對(duì)PRV的gD蛋白和gE蛋白進(jìn)行了截短表達(dá)，獲得了均以包涵體形式表達(dá)的重組gD蛋白和重組gE蛋白，重組蛋白純化后經(jīng)Western blot檢測(cè)表明重組gD蛋白可與PRV陽(yáng)性血清、PRV疫苗免疫血清均發(fā)生特異性免疫學(xué)反應(yīng)，重組gE蛋白僅與PRV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性免疫學(xué)反應(yīng)，而與PRV疫苗免疫血清未發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，重組gD蛋白和重組gE蛋白表現(xiàn)出的良好免疫學(xué)活性和特異性為試驗(yàn)后期建立高度敏感、特異的診斷試劑奠定了基礎(chǔ)，以純化的重組gD蛋白和重組gE蛋白作為檢測(cè)抗原建立了gD-間接ELISA方法和gE-間接ELISA方法，經(jīng)敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)以及臨床應(yīng)用顯示gD-間接ELISA方法和gE-間接ELISA方法均具有良好的敏感性、特異性、重復(fù)性以及臨床適用性。通過(guò)gD-間接ELISA方法可以掌握豬群的整體抗體水平，gD-間接ELISA方法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣品數(shù)，即為豬群的PRV整體抗體陽(yáng)性率。通過(guò)gE-間接ELISA方法可以掌握豬群的PRV野毒抗體水平，gE-間接ELISA方法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣品數(shù)，即為豬群的PRV野毒感染的抗體陽(yáng)性率。通過(guò)gD-間接ELISA方法和gE-間接ELISA方法檢測(cè)結(jié)果中的陽(yáng)性樣品數(shù)差值可以掌握豬群的PRV疫苗免疫抗體水平，gD-間接ELISA方法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性而gE-間接ELISA方法檢測(cè)結(jié)果為陰性的樣品數(shù)，即為豬群的PRV疫苗免疫的免疫抗體陽(yáng)性率。gD-間接ELISA方法和gE-間接ELISA方法的聯(lián)合應(yīng)用不僅可以評(píng)價(jià)疫苗免疫后的抗體水平，而且可以實(shí)現(xiàn)PRV野毒感染的鑒別檢測(cè)?？傊?，本研究中建立的gD-間接ELISA方法和gE-間接ELISA方法及兩種方法的聯(lián)合應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了PRV免疫抗體和野毒抗體的鑒別檢測(cè)，對(duì)提高我國(guó)基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的PRV鑒別檢測(cè)水平和推進(jìn)我國(guó)PRV凈化進(jìn)程均具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。