鄧先智,類延寶,沈 杰,李 楊,李露航,包寒陽,扎瓊巴,Ｐｌｅｎｋｏｖｉｃ ′ ￣Ｍｏｒａｊ 孫 庚,*

1中國-克羅地亞生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)服務“一帶一路”聯(lián)合實驗室,中國科學院山地生態(tài)恢復與生物資源利用重點實驗室,生態(tài)恢復與生物多樣性保育四川省重點實驗室,中國科學院成都生物研究所,成都 610041 2 中國科學院大學,北京 101408 3 西南民族大學青藏高原研究院,成都 610041 4 扎瓊倉生態(tài)文化交流中心,若爾蓋 747205 5 克羅地亞薩格勒布大學理學院生物系,薩格勒布 10000

青藏高原作為我國重要的生態(tài)安全屏障區(qū),具有水源涵養(yǎng)、土壤保持和生物多樣性保護等核心功能[1],但其脆弱的生態(tài)環(huán)境對氣候變化和人類活動干擾極為敏感[2—3]。近年來,高寒草地退化面積每年增加5%—10%[4],退化草地面積已達到2920萬hm2,占青藏高原草地總面積的38.8%[5]。土壤是陸地生態(tài)系統(tǒng)最大的碳貯蓄庫[6—7],退化導致草地生產(chǎn)力下降[8]、土壤養(yǎng)分流失,碳儲量急劇下降[9],進而嚴重影響牧區(qū)的經(jīng)濟生活和草地生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展。最近研究發(fā)現(xiàn),退化草地表現(xiàn)出巨大的固碳潛力[10],可通過促進退化草地的恢復來提升土壤固碳效應[11],這為我國實現(xiàn)“雙碳”目標提供了新的途徑。

土壤有機碳的來源與組成十分復雜[12],目前關于土壤有機碳的形成過程逐漸從過去的腐殖質理論轉變?yōu)殛P注微生物的轉化與調控作用[13—15]。在碳循環(huán)過程中,土壤微生物具有雙重生態(tài)效應,不僅可通過分解作用向大氣中釋放CO2,還可利用自身合成代謝將外源碳轉化成以微生物殘體的形式累積在土壤中[16—19]。生物標志物氨基糖是微生物細胞壁的重要成分,在微生物死亡后仍然可以在環(huán)境中保存很長時間,因此土壤中長期積累的氨基糖主要來自于微生物殘體[20]。由于土壤中胞壁酸(MurA)只來源于細菌,而氨基葡萄糖(GluN)主要來自真菌,因此可用GluN/MurA來評價真菌和細菌殘體在土壤有機質形成過程中的相對貢獻[21]。隨著生物標志物研究方法的發(fā)展,越來越多的研究顯示微生物殘體是土壤有機碳的重要組成部分[22—27],這對有機碳的長期固持和積累具有重要意義。

植物根系分泌物作為植物-土壤-微生物“交流”的媒介[28],可通過根系分泌物濃度的變化向根際微生態(tài)系統(tǒng)發(fā)出反饋信號,調控物質的遷移和轉化[29—30]、影響微生物[31]和根系生長[32]以及土壤酶活性的變化[33—34]。有研究發(fā)現(xiàn),根系分泌物的濃度和種類受植物生長時期、生長環(huán)境和植物種類的影響[35—36]；大多數(shù)植物的根系分泌物在生長期分泌量較多[37—39],并且不同植物種類之間組分差異較大[40]。另外,當土壤氮素較低時,根系分泌物會刺激土壤有機質分解合成額外的氮[41—42]。植物根系分泌物的C/N通常要比根際微生物的C/N高,這可能造成根際微生物與植物根系之間對環(huán)境有效氮素的激烈競爭,使得根際成為碳過多而有效氮獲取受限制的區(qū)域[43—44]。除此之外,Yang等[45]通過胞外酶化學計量比證據(jù)發(fā)現(xiàn),草地恢復過程中微生物活動由磷受限向氮受限轉變。因此,根系分泌物氮或碳氮比可能是驅動根際微生物群落組成和活性的重要調控因子,直接影響根際環(huán)境養(yǎng)分代謝等過程[46],進而影響退化草地微生物殘體碳的形成。

目前關于微生物殘體對根系分泌物輸入響應的直接試驗證據(jù)幾乎還沒有報道,故本研究以高寒極度退化草地土壤為研究對象,通過模擬根系分泌物輸入和利用氨基糖生物標志物的方法,來探討不同氮濃度和多樣性的根系分泌物對退化草地微生物殘體的影響,以期為根系分泌物調控下的碳循環(huán)研究提供理論依據(jù),同時也為高寒退化草地的有效恢復及土壤固碳增匯提供實踐指導。

1 材料與方法

1.1 供試土壤采集

本研究所用土壤為極度退化草地土壤,其物理結構和生態(tài)功能均受到嚴重破壞,便于分析根系分泌物輸入對微生物殘體的影響。采樣地點位于四川省若爾蓋麥溪鄉(xiāng)境內(33°56′—33°58′ N,102°11′—102°18′ E),平均海拔3430 m,屬典型高原寒溫帶濕潤季風氣候。年均氣溫1.3℃,年降水量615 mm,年蒸發(fā)量1352.4 mm,無絕對無霜期[47]；土壤類型原為高寒草甸土,退化為沙化土；樣地植被稀疏,主要的優(yōu)勢物種有沙生苔草(Carexspp)、賴草(Leymussecalinus(Georgi) Tzvel.)等沙生植物。隨機布置5個10 m×10 m的樣方,沿樣方對角線用內徑為3.5 cm的土鉆取0—20 cm表層土3鉆,每個樣方5個重復,將所取土樣混勻成一個混合樣品。用冰袋保存帶回實驗室,過2 mm細篩處理備用。試驗土壤的基本理化性質為全碳2.1 g/kg,全氮0.25 g/kg,全磷0.4 g/kg,pH 7.8,容重1.62 g/cm3。

1.2 試驗設計

本試驗參照Steinauer等模擬根系分泌物濃度及多樣性的配制方法[48],保持混合物中碳濃度(0.5 gC/kg)不變,設置2個不同氮含量的處理組(低氮-LN：0.1 gN/kg；高氮-HN：0.2 gN/kg),各組中分別設置添加2個不同多樣性根系分泌物的子處理(低多樣性-LD,添加物：葡萄糖、乙酸、甘氨酸；高多樣性-HD,添加物：葡萄糖、蔗糖、果糖、乙酸、乳酸、琥珀酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸)。共5個處理,分別表示為CK(不添加外源分泌物)、LN+LD、LN+HD、HN+LD及HN+HD,各處理均含3次重復。試驗中,配制低氮(C/N為5∶1)及高氮(C/N為5∶2)添加液時,按照表1各化合物(3種和9種)中碳原子個數(shù)占混合物的比例來確定各化合物的添加量。

表1 配制不同氮濃度和多樣性根系分泌物各組分碳原子個數(shù)占混合物的比例

試驗流程簡述如下：準確稱取400 g供試土壤于500 mL廣口瓶中,隨后置25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內避光培養(yǎng)15 d；培養(yǎng)期間,每24 h利用注射器(10 mL)緩慢、均勻加入7.5 mL的模擬根系分泌物溶液(預實驗表明,每日添加7.5 mL蒸餾水可維持土壤含水量在田間最大持水量的75%左右),CK處理加入等量的蒸餾水。

1.3 土壤總碳氮、微生物量碳氮、酶活性及氨基糖的測定

土壤總碳、氮測定[49]：將風干土樣利用研缽粉粹、混勻,過100目篩,準確稱80 mg粉粹土壤樣品,用錫紙包裹,使樣品不外漏,然后將樣品置于105 ℃烘箱中2 h,將處理好的樣品置于元素分析儀(Elementar Vario EL Ⅲ, 德國)測定。

土壤微生物量碳(MBC)及氮(MBN)用氯仿熏蒸硫酸鉀浸提法測定[50]。熏蒸：取培養(yǎng)后的鮮土25 g置于培養(yǎng)皿中,將其放入真空干燥箱中,并放置一個盛有50 mL去乙醇氯仿的燒杯(100 mL)(燒杯中放有玻璃球防止抽真空時瀑沸)和一個盛有稀氫氧化鈉溶液的小燒杯(吸收熏蒸期間釋放出來的CO2)；確定密封干燥器,之后用真空泵抽真空至氯仿沸騰5 min,關閉閥門,然后放入25 ℃培養(yǎng)箱中避光熏蒸24 h。浸提：將熏蒸后的土壤轉移至250 mL錐形瓶中,加入80 mL 0.5mol K2SO4,震蕩1 h(200 rev/min)后用定量濾紙過濾,收集濾液并冷凍保存。同時稱取等量未熏蒸土壤,并用上述方法進行浸提。上機：熏蒸和未熏蒸土壤的提取液用TOC儀(Milti N/C 2100S)進行含量測定。土壤MBC、MBN含量(mg/kg)計算公式如下:

(1)

(2)

式中,ΔEC、ΔEN為熏蒸與未熏蒸土壤碳氮含量的差值；kC為MBC的浸提系數(shù),為0.45；kN為MBN的浸提系數(shù),為0.54。

土壤酶活性測定[51]：土壤酸性磷酸酶(AP)、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(NAG)和β-葡萄糖苷酶(βG)活性采用多孔板熒光光度法測定；過氧化物酶(POD)活性采用多孔板分光光度法測定。

土壤氨基糖含量參照Indorf等的方法測定[52],具體步驟如下：稱取冷凍干燥后的土壤樣品1 g于10 mL水解瓶中,加入10 mL 6 mol/L的HCl溶液,密封后,置于高壓滅菌鍋中105 ℃水解8 h。冷卻至室溫后,加入100 μL 1 mg/mL內標肌醇溶液,振勻后過0.45 μm濾膜。濾液用旋轉蒸發(fā)儀蒸干,殘余物溶于20 mL去離子水后轉移至聚四氟乙烯小瓶中,并用0.4 mol/L KOH溶液將pH調至中性(pH 6.6—6.8),然后以3000 rpm/min離心10 min去除沉淀。上清液轉移至50 mL玻璃瓶中,凍干后,用3 mL無水甲醇溶解,離心10 min 使溶液中多余鹽分沉淀。將上清液轉移到5 mL衍生瓶中,在45 ℃下用N2吹干,再次加入1 mL去離子水并冷凍干燥(8 h以上)。向干燥后的樣品中加入300 μL衍生試劑,加蓋密封,在75—80 ℃水浴加熱30 min,其間振蕩 3—4次使反應均勻。冷卻至室溫后,加入1 mL乙酸酐,密封后,水浴加熱20 min。冷卻后,加入1.5 mL的二氯甲烷,渦旋使溶液混合均勻。過量衍生試劑的去除：首先,加入 1 mol/L HCl 溶液1 mL,渦旋震蕩30 s后,靜置后移除上層液體；隨后,用1 mL蒸餾水洗滌4次。去除過量衍生試劑后的樣品在 45 ℃下吹N2干燥后,溶于400 μL的乙酸乙酯-正己烷(v/v=1∶1)中,通過氣相色譜質譜聯(lián)用儀(Agilent 7890A- 5975C,USA)對產(chǎn)物進行分離和檢測。記錄樣品和標準品的保留時間,通過比較判斷氨基糖衍生物的峰值,將純化前向樣品中加入的肌醇作為內標對氨基糖進行定量分析。相關計算方法如下[24]：

(3)

BRC=45×MurA

(4)

MRC=FRC+BRC

(5)

式中FRC為真菌殘體碳(mg/kg)；BRC為細菌殘體碳(mg/kg)；MRC為微生物殘體碳(mg/kg)；251.23為胞壁酸(MurA)的分子量；179.17為氨基葡萄糖(GluN)的分子量；9和45分別為對應的轉換系數(shù)；

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

用單因素方差分析(One-way ANOVA)結合Turkey法檢驗模擬根系分泌物添加對退化草地土壤微生物殘體的影響,并考察各處理間土壤碳氮、微生物生物量、酶活性的差異顯著性(P=0.05)。利用線性回歸分析土壤微生物殘體與土壤碳氮、微生物生物量及酶活性等指標之間的關系。同時利用Pearson相關分析量化在根系分泌物添加下土壤碳氮、微生物生物量及酶活性之間的相關性。以上統(tǒng)計分析和作圖均在R 4.1.2(ggplot2包、hrbrthemes包)完成。

2 結果與分析

2.1 不同根系分泌物添加處理中的土壤總碳氮以及微生物量碳氮

培養(yǎng)后,各處理土壤總碳氮及微生物量碳氮的結果如圖1所示?？梢?LN+LD、HN+LD處理的土壤總碳分別顯著低于LN+HD、HN+HD處理,同時HN+HD處理顯著低于LN+HD處理。而LN+LD、HN+LD處理的微生物量碳含量分別顯著高于LN+HD、HN+HD處理,同時HN+LD、HN+HD處理分別顯著高于LN+LD、LN+HD處理,表明高氮含量及低多樣性的分泌物添加能有效促進土壤微生物的生長,并加速土壤碳庫的分解；而土壤總氮和微生物量氮在LN和HN兩組處理的組內及組間均無顯著差異,僅HN+LD的土壤總氮顯著高于LN+LD,HN+HD的微生物量氮顯著高于LN+HD。

圖1 不同根系分泌物添加對土壤總碳、總氮以及微生物生物量碳氮的影響Fig.1 Effects of different root exudates on soil total carbon, total nitrogen and microbial biomass carbon and nitrogen CK：對照；LN+LD：低氮濃度+低多樣性；LN+HD：低氮濃度+高多樣性；HN+LD：高氮濃度+低多樣性；HN+HD：高氮濃度+高多樣性；誤差線為標準偏差(n=3),柱上方不同小寫字母(a-e)表示不同處理間差異顯著(P<0.05)

2.2 不同根系分泌物添加中的氨基糖和微生物殘體碳

添加模擬根系分泌物各處理的微生物殘體碳和真菌殘體碳均顯著高于CK,且LN+LD、HN+LD處理中的微生物殘體碳和真菌殘體碳含量分別顯著高于LN+HD、HN+HD處理,同時在HN+LD處理顯著高于LN+LD處理,這說明LD和HN處理可能有助于微生物殘體的積累。同上比較下發(fā)現(xiàn),細菌殘體碳在LN+LD和HN+LD、LN+HD和HN+HD之間無顯著差異,僅HN+LD處理高于HN+HD處理。此外,結合各添加處理中GluN/MurA比例,土壤真菌與細菌殘體碳比例,表明退化草地微生物殘體主要由真菌殘體貢獻,且不受根系分泌物添加影響(圖2；表2)。

表2 根系分泌物添加下,土壤氨基葡糖糖、胞壁酸含量及其比例

圖2 不同根系分泌物添加對微生物殘體碳的影響Fig.2 Effects of different root exudates on microbial residues carbonCK：對照；LN+LD：低氮濃度+低多樣性；LN+HD：低氮濃度+高多樣性；HN+LD：高氮濃度+低多樣性；HN+HD：高氮濃度+高多樣性；誤差線為標準偏差(n=3),柱上方不同小寫字母(a-d)表示不同處理間差異顯著(P<0.05)

2.3 根系分泌物添加對土壤酶活性的影響

添加模擬根系分泌物各處理的土壤酸性磷酸酶、β-葡萄糖苷酶、過氧化物酶活性均顯著高于CK,而β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性顯著低于CK。另外,添加分泌物各處理間酸性磷酸酶活性無顯著差異；β-葡萄糖苷酶活性僅HN+LD處理顯著高于HN+HD處理；β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性HN+LD處理顯著高于其他添加處理；過氧化物酶活性僅HN+LD處理顯著高于LN+LD處理,其他添加處理間無顯著差異(圖3)。

圖3 不同根系分泌物添加對土壤酶活性的影響Fig.3 Effects of different root exudates on soil enzyme activityCK：對照；LN+LD：低氮濃度+低多樣性；LN+HD：低氮濃度+高多樣性；HN+LD：高氮濃度+低多樣性；HN+HD：高氮濃度+高多樣性；誤差線為標準偏差(n=3),柱上方不同小寫字母(a-d)表示不同處理間差異顯著(P<0.05)

2.4 微生物殘體碳與土壤C/N、MBC/MBN以及酶活性等的相關性

各土壤指標間的Pearson相關分析結果見表3。可知,土壤微生物量氮、酸性磷酸酶、過氧化物酶活性與土壤總氮含量呈顯著正相關(P<0.05)；微生物生物量碳與β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性呈顯著負相關(P< 0.01)；β-葡萄糖苷酶、過氧化物酶活性均與酸性磷酸酶呈現(xiàn)顯著正相關關系(P<0.01)；同時β-葡萄糖苷酶和過氧化物酶活性之間呈顯著正相關(P<0.05)。

表3 根系分泌物添加下,土壤碳、氮以及酶活性等指標之間的相關性

土壤微生物量C/N及相關酶活性與微生物殘體碳含量的線性回歸分析結果如圖4所示?？梢?該退化草地土壤中的微生物殘體碳含量與土壤C/N呈顯著線性負相關 (P<0.01),與MBC/MBN (P<0.001)、酸性磷酸酶(P<0.05)、β-葡萄糖苷酶(P<0.001)、過氧化物酶活性(P<0.05)呈顯著線性正相關,而與β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性無顯著性關系(P>0.05)。

圖4 微生物殘體碳與土壤碳氮比、微生物生物量碳氮比以及土壤酶活性的回歸分析(n=15)Fig.4 Regression analysis of microbial residual C to soil C/N ratio, microbial biomass C/N ratio and enzyme activities(n=15)

3 討論

根系分泌物因富含碳氮物質,可促進土壤微生物的生長并提升其活性,深刻影響土壤有機質分解和養(yǎng)分轉化過程[53—54]。土壤中微生物殘體的變化取決于生成和分解兩者之間的平衡,本研究探討了模擬根系分泌物輸入對高寒退化草地土壤微生物殘體的影響。結果表明,根系分泌物的輸入顯著增加了土壤微生物殘體碳含量,且受根系分泌物的氮濃度及多樣性的影響顯著。

3.1 根系分泌物通過影響土壤微生物來促進土壤微生物殘體生成

本研究中,根系分泌物的輸入同時提升了土壤微生物生物量碳氮和微生物殘體碳含量?？赡苁怯捎谕庠从袡C質輸入激活土壤微生物參與碳循環(huán)過程,促進微生物大量生長。土壤激發(fā)效應是微生物響應新鮮碳輸入對土壤有機碳分解的變化,是全球碳循環(huán)的關鍵組成部分[55]。有研究表明,向土壤中添加有效的低分子底物(如葡萄糖和氨基酸) 可以促進激發(fā)效應,激活休眠的土壤微生物,增加土壤微生物量[56—57]。此外,微生物氮礦化假說認為：外源碳的添加為土壤微生物獲取氮素提供能源,提高其氮礦化活性[58]。本研究中,在低根系生物量和植物凋落物輸入的退化草地環(huán)境下,外源根系分泌物的輸入可激活土壤微生物,增加土壤微生物殘體碳的生成,進而提升土壤有機碳的存儲量。

3.2 不同氮濃度和多樣性的根系分泌物對土壤微生物殘體的影響

本研究中,不同氮濃度和多樣性的根系分泌物處理對土壤微生物有不同的影響,高氮的根系分泌物添加促進土壤微生物生長的效果更顯著。與本研究結果相似,Chen等[59]研究也發(fā)現(xiàn),蔗糖和氮添加顯著加速有機質的礦化,但有機質礦化的速率由氮有效性控制,表明氮的有效性是影響土壤有機質分解的關鍵因子。Cui等[60]利用V-T模型發(fā)現(xiàn),高緯度草地的微生物代謝主要受到氮限制,證實了退化草地中氮是影響微生物生長及活性的關鍵因素。因此,本研究中高氮根系分泌物的輸入,有效緩解了高寒退化草地微生物代謝的氮限制,促進了微生物的生長。另外根系分泌物的多樣性對微生物的代謝以及生長的作用也存在差異性。有研究發(fā)現(xiàn),微生物對底物的利用存在偏好性[61]。比起其他碳源,微生物會優(yōu)先利用葡萄糖這類低分子化合物[62]。Lehmann等[63]研究也發(fā)現(xiàn),底物較低的多樣性有利于分解者群落專門化,而較高的多樣性會增加微生物利用這些底物的成本。因此,本研究中低多樣性根系分泌物輸入,減少了土壤微生物利用底物的成本,促進了退化草地土壤微生物殘體積累。

3.3 根系分泌物通過刺激土壤酶活性來影響土壤微生物殘體

土壤中酶介導的分解過程是控制全球養(yǎng)分循環(huán)的關鍵步驟[64]。本研究中,根系分泌物的輸入,增加了土壤β-葡萄糖苷酶、土壤磷酸酶和過氧化物酶活性,而降低了β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性。土壤磷酸酶可以將土壤中的有機磷分解成易于利用的速效磷,緩解微生物代謝的磷限制[65]。土壤中β-葡萄糖苷酶是纖維素水解酶,可以將寡糖水解成單糖,而過氧化物酶可參與木質素等大分子的降解,這兩者都可為土壤微生物提供可利用底物和能源[66],以提高微生物利用碳源的能力,這與Zhou等[67]的研究結果一致。因此,本研究中根系分泌物輸入可能通過增加上述相關酶活性,將土壤中的大分子進行“剪切”,使其轉化為可被微生物直接吸收利用的小分子[68],進而提高土壤“微生物碳泵”體內周轉速率[69]。這種高速的細胞周轉速率有利于土壤微生物殘體的積累。土壤中的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶可催化幾丁質和肽聚糖的水解[70],這兩種化合物是真菌和細菌殘體的主要部分。本研究中根系分泌物的輸入顯著降低了β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性,從而減少了土壤微生物殘體的分解。另一方面,作為含氮的化合物,幾丁質和肽聚糖也可作為微生物的潛在有機氮源；而外源根系分泌物氮的添加,可能緩解了土壤環(huán)境的氮限制,進而降低了微生物對上述內源氮(幾丁質和肽聚糖)的需求；最終使得β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性下降,并提高了土壤微生物殘體碳的含量。

4 結論

本研究基于“模擬根系分泌物輸入”控制試驗,發(fā)現(xiàn)根系分泌物輸入可顯著增加高寒退化草地土壤微生物殘體含量,且以真菌殘體為主,其中高氮和低多樣性處理增加最明顯。根系分泌物的輸入可增加土壤β-葡萄糖苷酶、土壤磷酸酶和過氧化物酶活性,促進微生物的生長,而降低β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性,減少微生物殘體的分解。這表明在未來退化草地恢復中,可充分利用模擬根系分泌物輸入的土壤固碳策略,即通過提高土壤氮的有效性,促進微生物的生長,加快代謝周轉,進一步提高微生物殘體含量。