黃文文,張全國

1 河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,新鄉(xiāng) 453003 2 北京師范大學(xué)生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點實驗室,北京 100875

病毒是地球上數(shù)量最多的生物類群[1],僅海洋中的病毒樣粒子(virus-like particles,VLPs)就超過1030個[2]。有若干研究證實了海洋病毒是海洋藻類和細菌死亡率的主要貢獻者、微生物多樣性維持的關(guān)鍵影響因素和海洋系統(tǒng)生物地球化學(xué)循環(huán)的重要驅(qū)動因素[2—3]。如海洋生態(tài)系統(tǒng)中,光合作用固定的碳約有50%由于“病毒轉(zhuǎn)軌”作用而未能流入更高營養(yǎng)級；病毒轉(zhuǎn)軌過程中新產(chǎn)生的微生物有一半被病毒裂解,因此,約25%的固定碳由于病毒裂解而以CO2形式釋放[4]。

人們對陸地生態(tài)系統(tǒng)中病毒的認識相對有限[5]。目前,土壤中被鑒定出的病毒種類僅約27000種[6],且大多數(shù)土壤病毒粒子被證實為噬菌體[7]。土壤噬菌體與土壤細菌群落組裝和功能具有相關(guān)性[8]——它們通過捕食或寄生的方式控制細菌的數(shù)量,通過轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式促進細菌之間的基因轉(zhuǎn)移,改變土壤環(huán)境中細菌的種類和多樣性[9—11]。然而,也有學(xué)者認為,盡管一些針對土壤中特定細菌(如根瘤菌和植物病原菌)的噬菌體的研究證實了噬菌體捕食作用對細菌群落動態(tài)的影響,但土壤中90%以上的病毒粒子似乎都被強烈地吸附在土壤表面[3],因此,土壤病毒的捕食作用對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和活性的總體影響仍不明確[12]。

土壤病毒多度因受土地利用方式[13—14]、土壤類型[12]、土壤濕度[15—17]和植被類型[7]等因素的影響而差異顯著,如黃土平原土壤中每克干土的VLPs可達1.97×1010個[18],而熱帶沙漠土壤中僅有2.2×103個[19]。干燥條件下土壤病毒更容易失活[3],土壤病毒多度往往隨含水量增加而上升[17], 但水分增加的同時也會導(dǎo)致蒸發(fā)加快進而對病毒產(chǎn)生負面影響[3]。因此,盡管土壤含水量是驅(qū)動土壤細菌和病毒多度變化的重要因素[15—16],但現(xiàn)有報道展示的數(shù)據(jù)還不足以明確其與土壤病毒多度的關(guān)系[7]。

土壤含水量可通過多種途徑影響土壤異養(yǎng)呼吸[20],而病毒對細菌的下行控制作用可能是其中之一,如土壤含水量驅(qū)動土壤病毒-細菌多度比發(fā)生變化的過程[15—16],會影響病毒裂解細菌時釋放的不穩(wěn)定性碳的含量,進而影響到微生物生物量和土壤呼吸[7]。此前,施加病毒滅活劑的研究發(fā)現(xiàn),由于病毒對細菌下行控制作用的存在,病毒多度的降低可以增加細菌多度進而加速土壤異養(yǎng)呼吸[21]；但在另一項碳添加的微宇宙實驗中,土壤新病毒的產(chǎn)生只是源于一部分宿主細菌,土壤呼吸速率隨病毒多度的增加而增加[22]。因此,病毒既可通過降低細菌數(shù)量而減緩?fù)寥喇愷B(yǎng)呼吸,也可通過增加細菌群落的更新速率(活躍狀態(tài)細菌數(shù)量上升)而加速土壤呼吸。然而,長期以來,人們卻忽略了土壤微生物(細菌、古菌、真菌、原生動物和線蟲)的捕食者和寄生者——病毒——在水分引起土壤異養(yǎng)呼吸變化過程中的作用。本研究比較不同含水量條件下土壤細菌、病毒以及異養(yǎng)呼吸速率的變化規(guī)律,推斷病毒對細菌的下行控制作用是否受水分條件的影響,從土壤細菌和病毒多度與呼吸速率的關(guān)系,推斷病毒下行控制影響土壤呼吸速率的機制,以期了解含水量對土壤生態(tài)系統(tǒng)中病毒下行控制作用的影響,為陸地生態(tài)系統(tǒng)中病毒-細菌關(guān)系的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤采集

以北京師范大學(xué)生物園內(nèi)試驗田(39°57′43″ N,116°21′21″ E)的土壤作為供試土壤。于2020年12月6日,將地面0—15 cm處的土壤去除凋落物和較大砂礫后,充分混勻,過2 mm篩,帶回實驗室。試驗田年均溫度為11—13℃,年均降水量約644 mm,土壤類型為褐土。生長季所種作物為玉米(Zeamays)。玉米收獲后,地上部分有狗尾草(Setariaviridis)、薊(Cirsiumjaponicum)和牽牛(Pharbitisnil)等零星生長。本研究采集土壤樣品時,上述植物均已凋亡。

1.2 土壤培養(yǎng)試驗

經(jīng)烘干法確定土壤含水量后,所采土壤樣品被分裝至96個250 mL的藍蓋瓶中,每個微宇宙瓶裝入相當于200 g干重的鮮土,置于26 ℃的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)12 d,以便土壤微生物有充足的時間在新環(huán)境中恢復(fù)生長。預(yù)培養(yǎng)期間,每2 d校正一次水分,使每個微宇宙瓶的土壤含水量保持在13%(接近原土壤含水量)。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后,將96個微宇宙瓶隨機分為3組,并參考Zhang和Zhang的研究[23]將土壤含水量設(shè)置為3個水平：恒定低水分處理(土壤含水量為13%,接近田間持水量的39%)；恒定高水分處理(含水量為26%,接近田間持水量的78%)和波動水分處理(土壤含水量在26%—13%之間波動) (圖1),設(shè)置水分處理的這一天記作培養(yǎng)試驗第0天。除測定土壤呼吸的階段之外(見1.3),微宇宙開放瓶蓋培養(yǎng)。整個試驗期間,低水分和高水分處理的土壤微宇宙,每2 d校正一次含水量；波動水分處理的微宇宙,在第0天將水分調(diào)至26%后,每2 d測定一次,當平均含水量低于13%時,將所有微宇宙含水量調(diào)至26%(水分校正時間在第0天和第18天)。試驗過程中對微宇宙進行了4次破壞性采樣(采樣時間在培養(yǎng)試驗的第2、16、22天和第34天,對應(yīng)的波動水分處理的土壤含水量分別為26%、13.33%、26%和17.49%),每次破壞性采樣時,3個水分處理各有8個微宇宙被采樣。本試驗對時間因素的研究采用的是空間代替時間策略,在不同時間點上破壞性取樣不同的土壤微宇宙。

1.3 土壤呼吸測定

每個土壤微宇宙在破壞性取樣之前進行了土壤呼吸測定。每次測定土壤呼吸時,微宇宙密閉培養(yǎng)2 d或4 d——使用橡膠瓶塞封閉瓶口。注射器針頭連接CO2濃度分析儀后,刺透橡膠瓶蓋,對閉蓋培養(yǎng)前和培養(yǎng)后的土壤微宇宙空氣中CO2濃度進行測定。通過向微宇宙中裝入已知體積的干土來估計每個土壤微宇宙的氣體體積。每次土壤呼吸測定之后,立即進行相應(yīng)的破壞性采樣。

1.4 土壤細菌和病毒提取

每個土壤樣品分別提取三份細菌和病毒懸浮液。土壤細菌的提取采用密度梯度離心法[24]。將0.2 g鮮土、0.44 g 聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrolidone, PVPP)和800 μL無菌水加入1.5 mL離心管,高速渦旋1 min,4℃ 100×g離心2 min,吸取350 μL離心后的土壤懸浮液至裝有700 μL密度梯度分離液OptiPrep (1.32 g/mL)的2 mL離心管上層,4℃ 13000×g離心30 min后,去除375 μL上層上清液,將剩余的675 μL液體轉(zhuǎn)移至新的2 mL離心管中,加1350 μL無菌水后,將二者輕輕渦旋混勻,4℃ 13000×g離心20 min, 去除1700 μL上層懸浮液,以洗去菌液中的游離DNA碎片,余下的液體在4℃ 13000×g離心10 min,棄除殘余液體后,向離心管內(nèi)加入1.5 mL 1% TE緩沖液,振蕩混勻后,將細菌提取液轉(zhuǎn)移至凍存管,并加入50%丙三醇,振蕩10 s,使用液氮速凍后儲存于- 80 ℃條件下待用。

土壤病毒提取在Ashelford等[25]和 Williamson等[9]方法的基礎(chǔ)上略作修改。向盛有5 g鮮土和20顆無菌鋼珠的50 mL離心管加入20 mL 1%的檸檬酸鉀溶液(每1L檸檬酸鉀溶液中,含10 g C6H5K3O7· H2O,1.44 g Na2HPO4· 7H2O,0.24 g KH2PO4,pH=7；溶液配制后儲存于4℃條件下),高速渦旋1 min后,在200 rpm的條件下振蕩10 min,轉(zhuǎn)移至4℃的黑暗環(huán)境中孵育15 min,以實現(xiàn)病毒粒子和土壤團聚體的物理分散。4℃ 2000×g離心30 min后,將此時獲取的上清液過0.22 μm孔徑的無菌針頭式過濾器去除細菌和土壤小顆粒。將濾液轉(zhuǎn)移至凍存管,經(jīng)液氮速凍后儲存于- 80℃冰箱。

1.5 土壤細菌和病毒計數(shù)

使用熒光染料SYBR Green I對土壤細菌細胞和病毒樣粒子進行染色[26]后,通過熒光顯微鏡對土壤細菌和病毒進行計數(shù)[18]。取200 μL解凍后的土壤細菌提取液,加入1800 μL無菌水稀釋；用無菌鑷子夾取25 mm直徑,0.8 μm孔徑的NC膜放在0.45 μm孔徑的抽濾承載裝置上,用無菌水將NC膜完全濕潤后,再夾取直徑25 mm,孔徑0.2 μm的Isopore濾膜置于NC膜上,使二者緊密貼合,連接過濾柱,將稀釋過的細菌提取液加入抽濾裝置,打開抽濾泵直至菌液抽濾完成。

取900 μL解凍后的土壤病毒液,加入100 μL 10 × DNase I反應(yīng)緩沖液和2 μL DNase I(2500 U/mL),顛倒混勻,置于37 ℃條件下,以去除病毒液中的游離DNA,30 min后,加入35 μL 0.5 mol 的EDTA終止反應(yīng)。取200 μL 經(jīng)DNase I處理過的土壤病毒液,加入1800 μL無菌水稀釋。用無菌鑷子夾取NC膜放在抽濾承載裝置上,待其完全濕潤后,夾取直徑25 mm,孔徑0.02 μm 的Al2O3Anodisc濾膜置于NC膜上,連接過濾柱,加入稀釋過的病毒提取液,打開抽濾泵直至病毒液抽濾完成。

當細菌或病毒樣品抽濾完成后,加500 μL 5 × (原液稀釋2000倍)的SYBR Green I熒光染料,黑暗中染色20 min,將染料抽濾干凈,在抽濾泵開著的情況下,用移液槍吸取1mL無菌水清洗抽濾裝置3—5次,細菌或病毒濾膜制作完成。

在干凈的載玻片中央加30 μL熒光抗淬滅劑(每1 mL熒光抗淬滅劑含500 μL PBS, 500 μL丙三醇,0.001—0.003 g對苯二胺),用無菌鑷子夾取細菌或病毒濾膜置于其上,再加30 μL抗淬滅劑在細菌或病毒濾膜上,蓋上蓋玻片,輕輕按壓至無氣泡。細菌和病毒裝片制作完成后,立即使用熒光顯微鏡對其進行拍照,它們在450—490 nm波長的藍光激發(fā)下呈亮綠色。每個玻片至少隨機拍攝10個視野。細菌和病毒多度使用ZEISS ZEN 3.0軟件計數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

在 R[27]環(huán)境下對數(shù)據(jù)進行分析。本試驗在不同時間點對土壤微宇宙進行破壞性取樣,因此將不同時間點上的土壤微宇宙視為獨立樣本進行分析。數(shù)據(jù)分析前對細菌和病毒多度進行以10為底的對數(shù)轉(zhuǎn)化,病毒-細菌多度比(virus-to-bacteria ratio, VBR)做平方根轉(zhuǎn)化。對于波動水分處理的土壤微宇宙,時間可能不是一個有意義的解釋變量,因為其作用可能與水分變化的作用相混淆。因此,以采樣時間作為隨機效應(yīng),使用線性混合效應(yīng)模型(lmer)[28]分析土壤濕度對土壤呼吸速率、細菌多度、病毒多度和VBR值的影響(gaussian family),并使用“l(fā)smeans”包對不同水分處理進行多重比較。用單因素方差分析比較不同時間點土壤微宇宙的呼吸速率、細菌和病毒多度的差異。

土壤含水量、細菌多度、病毒多度和土壤呼吸速率這些變量之間可能存在著相對復(fù)雜的影響途徑,比如土壤含水量可以通過物理化學(xué)過程直接影響土壤呼吸,也可能通過改變細菌多度進而影響呼吸速率。受限于變量數(shù)量和實驗樣本量,本試驗的數(shù)據(jù)無法使用結(jié)構(gòu)方程模型進行分析,因此,本研究使用了三個遞進式的廣義線性模型(glm)[28]對上述變量進行分析：第一,分析觀測含水量如何影響細菌多度；第二,分析觀測含水量和細菌多度如何影響病毒多度；第三,分析觀測含水量、細菌多度和病毒多度如何影響土壤呼吸。用“car”提供的“Anova”功能(Type II test)來估計解釋變量影響的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 土壤細菌多度、病毒多度以及土壤異養(yǎng)呼吸速率對土壤含水量變化的響應(yīng)

在三種水分處理下,土壤細菌多度皆高于病毒多度。相較于更接近自然狀況的低含水量(13%)處理,高水分處理和波動水分處理都未能顯著改變細菌多度,但顯著增加了病毒多度(P<0.001),也相應(yīng)地增加了病毒-細菌多度比(P=0.0026) (表1)。在低水分處理下,不同時間點采樣的土壤微宇宙的細菌多度無顯著差異,但病毒多度顯著降低(F3,28=10.74,P<0.001)。在高水分處理下,細菌和病毒多度并非隨時間保持恒定,而是表現(xiàn)出了動蕩的信號：第16天細菌多度顯著高于第2天(P=0.0211),第22天則極顯著降低(P<0.001),在第34天恢復(fù)到與第2天無顯著差異(P=0.9849)；病毒多度在第2、16天和第22天之間逐漸增加,而在第34天顯著低于第16(P=0.0205)和22天(P=0.0121),病毒-細菌多度比則在第22天為最高(F3,28=7.88,P<0.001)。波動水分處理下,土壤細菌和病毒多度均未隨時間推移表現(xiàn)出明顯的變化(圖1)。

高水分和波動水分處理的土壤呼吸速率皆極顯著高于低水分處理(P<0.001) (表1)。隨時間推移,低水分處理的土壤微宇宙呼吸速率極顯著降低(F3,28=86.18,P<0.001),高水分處理的土壤微宇宙呼吸速率先升高后降低(F3,28=34.97,P<0.001),波動水分處理的土壤微宇宙呼吸速率則與土壤含水量的變化緊密相關(guān)(F3,28=64.58,P<0.001)(圖1)。

表1 土壤細菌多度、病毒多度、病毒-細菌多度比和呼吸速率對不同水分處理的響應(yīng)

圖1 低水分、高水分和波動水分處理土壤微宇宙的細菌多度、病毒多度和呼吸速率隨時間的變化(數(shù)據(jù)為平均值±標準誤,n=8)Fig.1 Changes of soil bacterial abundance, viral abundance and respiration rate of the low-, high- and fluctuating-water content microcosms over time (Data show mean±SE, n=8)

2.2 土壤呼吸速率與土壤含水量、細菌多度和病毒多度之間的關(guān)系

由表2可知,土壤含水量與病毒多度呈顯著正相關(guān)(P<0.001),而與細菌多度無顯著的相關(guān)關(guān)系(P=0.9173)。土壤含水量(P<0.001)、細菌多度(P=0.0045)和病毒多度(P<0.001)均與土壤呼吸速率具正相關(guān)關(guān)系。

表2 土壤呼吸速率、含水量、細菌多度、病毒多度之間的相關(guān)性

3 討論

不同環(huán)境中病毒多度存在較大差異,土壤中VBR變幅更大[29],一些關(guān)于土壤生態(tài)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)病毒多度高于細菌多度[9, 18]；但也有細菌多度高于病毒多度的情況[10, 16, 19, 25]。本研究的結(jié)果與后者相一致(表1),這一結(jié)果支持此前學(xué)者提出的觀點：農(nóng)田土壤可能受施肥[30]和根際效應(yīng)[6,10,25,31]的影響,而表現(xiàn)出細菌多度高于病毒多度的現(xiàn)象。

3.1 土壤含水量對細菌多度、病毒多度和異養(yǎng)呼吸速率的影響

土壤病毒是否會對細菌產(chǎn)生明顯的下行控制,這一基本問題目前并無明確答案[31]。一般認為,在相對干旱的土壤中(如本研究的供試土壤),含水量上升會促進微生物生長[16,32]。本研究發(fā)現(xiàn)土壤水分上升并不會增加細菌多度,與此同時,病毒多度上升,且病毒-細菌比例上升(表1,圖1),這暗示著在高水分土壤中病毒造成的下行控制可能會有效地阻止細菌數(shù)量上升；而在低水分處理中,更低的病毒-細菌比例暗示著更弱的下行控制。這一結(jié)果和資源充足環(huán)境中下行控制更重要的主流觀點是一致的[2],即病毒造成多么重要的下行控制很可能依賴于環(huán)境資源水平[7]。當然,土壤生境中病毒和細菌的關(guān)系可能比本文描述的要復(fù)雜,特別是溫和性噬菌體對細菌是否會造成下行控制[33],以及當這種下行控制作用受到環(huán)境因子影響時所表現(xiàn)出的顯著差異——如Virginia一處山地土壤中存在著病毒對細菌的下行控制作用,而濕地土壤中則沒有[16]。

值得注意的是,土壤水分的改變不一定僅通過改變細菌而間接影響病毒。土壤干燥會影響病毒失活的速率,尤其是干燥程度低于某個臨界點時,水分蒸發(fā)和土壤濕度過低,會導(dǎo)致病毒失活[3],如I型脊髓灰質(zhì)炎病毒在18%—2.9%水分含量之間的失活率基本相同,但當水分含量在1.2%—0.6%之間時,病毒的失活率顯著增加[34]。本研究中病毒多度的變化和上述研究相似：土壤含水量在26%—13%之間波動時,病毒多度無顯著差異；但當土壤濕度持續(xù)在13%時(兩次校正水分的時間段內(nèi),土壤含水量維持在10%—13%),水分蒸發(fā)可能會顯著影響病毒多度(圖1)。

本研究發(fā)現(xiàn),土壤含水量與土壤呼吸速率密切相關(guān)(表2)：在恒定低水分處理的土壤微宇宙中,隨時間推移,土壤呼吸速率顯著下降,這可能是因為當土壤干燥到一定程度后,微生物的生理狀況以及營養(yǎng)物質(zhì)在土壤孔隙中的擴散受到限制,土壤微生物的代謝活動降低[35],土壤團聚體和土壤膠體的結(jié)合更加緊密,因此,大部分土壤有機質(zhì)難以被土壤微生物分解[36],從而抑制了土壤呼吸(圖1)；相較于過高或過低的土壤含水量,適中的含水量會獲得最高的土壤呼吸速率[37],在本研究的恒定高水分處理下,土壤呼吸出現(xiàn)先上升后下降的趨勢,但總體而言,高水分處理下的土壤呼吸速率要顯著高于低水分和波動水分處理(表1,圖1)。波動水分處理下(本研究中波動水分的處理與自然界中降水模式對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響高度相似)的土壤微宇宙,其呼吸速率與含水量變化趨勢一致(圖1),這一現(xiàn)象和“Birch效應(yīng)”[38]高度吻合,即突然的“降水”能增加土壤的呼吸速率[23]。

3.2 病毒-細菌關(guān)系對土壤異養(yǎng)呼吸速率的影響

本研究中,土壤含水量、細菌多度和病毒多度都是呼吸速率的正向顯著預(yù)測變量(表2)?，F(xiàn)有研究表明,含水量和細菌多度對呼吸速率的作用比較明確[20],而病毒多度的作用尚無答案。一般認為,病毒多度可能通過兩個途徑對呼吸速率產(chǎn)生影響：第一,病毒顆粒本身是呼吸過程的底物,但相較于細胞形態(tài)的生物質(zhì),病毒顆粒具有較低的碳含量[3],因此病毒多度通過此途徑影響呼吸速率的作用可能有限；第二,病毒對細菌的下行控制作用影響了土壤呼吸速率。宿主細菌被噬菌體裂解之后,釋放出病毒顆粒,并產(chǎn)生細胞碎片,增加了土壤中不穩(wěn)定性碳的含量,進而增加了土壤微生物生物量和土壤呼吸[7]。本研究中,病毒多度的上升沒有造成細菌數(shù)量的明顯改變(表2),這可能是因為,盡管大多數(shù)的環(huán)境病毒都是噬菌體,但土壤生態(tài)系統(tǒng)中已知的2000多種噬菌體僅感染11個細菌門的宿主[7],且其中85%的噬菌體只感染γ變形菌門、厚壁菌門和放線菌門的細菌[39],因此,噬菌體裂解細菌的過程可能造成細菌群落中那些被病毒感染的種群處于活躍生長階段(有更高的代謝速率和分解有機物的潛能)[11],而這些活躍著的病毒和細菌種群貢獻了大量的CO2流出[40]。當然,更高的病毒多度意味著更高的微生物死亡率[41],亦即更快速的微生物群落更新,而更快的更新可能伴隨著群落物種組成的改變[7]。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn),相較于恒定低含水量,波動含水量顯著增加了土壤病毒多度和土壤異養(yǎng)呼吸速率。恒定高含水量也顯著增加了土壤病毒多度,且病毒對細菌的下行控制作用增強,阻止了土壤細菌多度的上升；此外,病毒多度的增加可能使土壤中受噬菌體影響的那部分細菌處于活躍生長階段,從而增加了土壤異養(yǎng)呼吸速率。結(jié)果表明,土壤含水量對土壤病毒多度的變化產(chǎn)生了重要影響,并對病毒多度和細菌多度與土壤異養(yǎng)呼吸關(guān)系驅(qū)動的過程做出了潛在貢獻。因此,土壤病毒對土壤微生物造成的下行控制可能是碳循環(huán)等生態(tài)過程的重要決定因素。

與水體病毒生態(tài)學(xué)的研究進展相比,人們對土壤生態(tài)系統(tǒng)中細菌及其噬菌體之間的相互作用知之甚少。本研究初步揭示了不同含水量對土壤中病毒和細菌關(guān)系變化的影響,以及生態(tài)系統(tǒng)功能對這種關(guān)系變化的反饋,擴大了人們對土壤生態(tài)系統(tǒng)中細菌-病毒關(guān)系的認知,為土壤生態(tài)系統(tǒng)中病毒對微生物群落結(jié)構(gòu)影響等相關(guān)研究提供了理論支撐。

致謝：感謝圣路易斯華盛頓大學(xué)(Washington University in Saint Louis)梁小龍博士在土壤病毒裝片過程中給予的幫助。