高效液相色譜法同時測定茉莉花純露中5 種香氣成分

張榮林，呂敏，薛亞馨，陸小康，陳小聰

(廣西-東盟食品檢驗檢測中心，南寧 530029)

茉莉為木犀科素馨屬植物，其花為著名的花茶原料及重要的香精原料，廣西橫縣、四川犍為、福建福州、云南元江是我國茉莉花主要種植產(chǎn)地[1]。茉莉花辛甘、溫，具有理氣、開郁、辟穢、和中等功效[2]。茉莉花中含有揮發(fā)性成分，主要為芳樟醇、乙酸葉醇酯、苯甲酸甲酯、乙酸芐酯、順-3-苯甲酸己烯酯、α-法尼烯、鄰氨基苯甲酸甲酯、吲哚[3-7]，這些揮發(fā)性成分可用于窨制花茶和提取香精，以茉莉花提取的茉莉花凈油、精油、純露等加工品廣泛使用于食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)[6]。茉莉花純露是茉莉花通過水蒸氣蒸餾，經(jīng)冷凝收集得到的含有茉莉花香氣成分的水溶液。研究表明，茉莉花中揮發(fā)性成分的種類及含量受到茉莉花品種[8]、產(chǎn)地[9-11]、環(huán)境[12，13]、花的開放程度[14]等因素影響，為了有效控制茉莉花純露的質(zhì)量，有必要建立茉莉花純露中多種香氣成分含量測定方法。茉莉花純露中主要含有苯甲醇、鄰氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸芐酯及芳樟醇等揮發(fā)性成分[3-7]，關(guān)于茉莉花及茉莉花精油、茉莉花凈油中香氣成分的定性分析和含量測定已有研究[15-17]，但同時測定茉莉花純露中苯甲醇、鄰氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸芐酯及芳樟醇5 種揮發(fā)性成分的含量尚未見報道。食品、藥品中揮發(fā)性成分含量的測定多采用氣相色譜法檢測[18-21]，但我國氣相色譜儀普及率低于液相色譜儀，同時液相色譜具有適用性強，應(yīng)用范圍廣等特點，因此利用高效液相色譜測定茉莉花純露中揮發(fā)性成分具有重要意義。

筆者參考文獻[22-23]，采用高效液相色譜法同時測定茉莉花純露中苯甲醇、鄰氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸芐酯和芳樟醇等5 種香氣成分含量，為建立茉莉花純露的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、品質(zhì)評價方法提供數(shù)據(jù)和參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Prominence-i LC-2030C 型，配有Labsolution 工作站，二極管陣列檢測器，日本島津公司。

電子分析天平：XS-205DU 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量分數(shù)為99.9%，編號為CDCT-C10569000，德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

乙酸芐酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量分數(shù)為99.4%，編號為DRE-C10015515，德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

鄰氨基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量分數(shù)為99.9%，編號為MAI-722306，美國Stanford Analytical Chemicals 公司。

吲哚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量分數(shù)為99.5%，編號為CCFD 200282，美國CATO 公司。

芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量分數(shù)為98.4%，編號為CCFD 200166，美國CATO 公司。

乙腈、甲醇：均為色譜純，德國默克公司。

茉莉花純露樣品：市售。

實驗用水為去離子水，由Millipore 型純水機制備。

1.2 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，月旭科技(上海)股份有限公司]；流動相：A 為乙腈，B 為水，流量為1.0 mL/min；梯度洗脫程序：0～6 min 時，流動相A 體積分數(shù)為42%，6～10 min 時，流動相A 體積分數(shù)由42%逐漸增加至65%，10～15 min 時，流動相A 體積分數(shù)由65%逐漸增加至90%，15～20 min 時，流動相A 體積分數(shù)為90%，20～25 min 時，流動相A 體積分數(shù)為42%；檢測波長：205 nm，柱溫：35 ℃，進樣體積：10 μL。

1.3 溶液配制

1.3.1 5 種香氣成分混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液

分別稱取苯甲醇、鄰氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸芐酯、芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，精密稱定，用甲醇溶解、稀釋、定容，配制成5 種香氣成分混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，其中苯甲醇質(zhì)量濃度為1.209 mg/mL、鄰氨基苯甲酸甲酯質(zhì)量濃度為1.083 mg/mL、吲哚質(zhì)量濃度為1.073 mg/mL、乙酸芐酯質(zhì)量濃度為1.062 mg/mL、芳樟醇質(zhì)量濃度為1.099 mg/mL。

1.3.2 5 種香氣成分系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

精密量取5 種香氣成分混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL，分別置于6 只10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線，混勻，配制成苯甲醇質(zhì)量濃 度 分 別 為6.045、12.09、24.18、48.35、96.70、120.9 μg/mL，鄰氨基苯甲酸甲酯質(zhì)量濃度分別為5.415、10.83、21.66、54.15、86.64、108.3 μg/mL，吲 哚 質(zhì) 量濃 度 分 別 為5.366、10.73、21.47、53.66、85.86、107.3 μg/mL，乙酸芐酯質(zhì)量濃度分別為5.311、10.62、21.25、53.11、84.98、106.2 μg/mL，芳 樟 醇 質(zhì) 量 濃度 分 別 為5.496、10.99、21.98、54.96、87.93、109.9 μg/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 樣品溶液

精密吸取茉莉花純露2.00 mL 至10 mL 容量瓶中，用水定容至標(biāo)線，混勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后，供液相色譜儀測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 檢測波長選擇

采用二極管陣列檢測器，在200～400 nm 波長范圍內(nèi)分別掃描5 種香氣成分混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(苯甲醇、鄰氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸芐酯、芳樟醇質(zhì)量濃度分別為12.09、10.83、10.73、10.62、10.99 μg/mL)以及樣品溶液，苯甲醇、鄰氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸芐酯和芳樟醇的紫外吸收光譜如圖1所示。由圖1 可以看出，芳樟醇為末端吸收，苯甲醇最大吸收波長為205 nm，鄰氨基苯甲酸甲酯最大吸收波長為216 nm，吲哚最大吸收波長為218 nm，乙酸芐酯最大吸收波長為206 nm。綜合各組分紫外吸收情況，確定采用檢測波長205 nm 同時測定苯甲醇、鄰氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸芐酯和芳樟醇，在此波長下基線穩(wěn)定，未見明顯漂移。

圖1 5 種香氣成分紫外吸收光譜圖

2.1.2 色譜柱選擇

分 別 考 察Ultimate XB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil 100-5-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil GOLD aQ 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)對5 種香氣成分的分離效果。結(jié)果表明，4種品牌的色譜柱均能較好地分離苯甲醇、鄰氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸芐酯和芳樟醇，但相同條件下Ultimate XB-C18柱色譜峰形最好，分離度滿足要求，且未見其它成分干擾，因此選擇Ultimate XB-C18色譜柱。

2.1.3 流動相選擇

分別考察了乙腈-水溶液、甲醇-水溶液兩種流動相體系，結(jié)果表明，以甲醇-水溶液作為流動相時，由于甲醇溶液受到紫外末端吸收的影響，基線波動較大。乙腈的傳質(zhì)阻力小于甲醇，同時乙腈和甲醇分別用同樣的比率與水混合時，乙腈的洗脫能力更強，色譜峰形更尖銳，因此選擇乙腈-水溶液作為流動相。

調(diào)節(jié)乙腈-水的體積比分別為65∶35、50∶50進行試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-水溶液(65∶35)作為流動相時，鄰氨基苯甲酸甲酯和吲哚的色譜峰部分重合，無法實現(xiàn)基線分離；以乙腈-水溶液(50∶50)作為流動相時，鄰氨基苯甲酸甲酯和吲哚的色譜峰分離度大于2，但芳樟醇的出峰時間延后，單針分析時間大于40 min。采用梯度洗脫，并對流動相配比進行優(yōu)化，5 種待測組分均實現(xiàn)基線分離，分析時間小于20 min，提高了分析效率，節(jié)約了分析成本，梯度洗脫程序見1.2。

2.2 色譜分離效果

分別精密吸取5 種香氣成分混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液，按1.2 色譜條件進樣測定，色譜圖如圖2 所示。由圖2 可以看出，芳樟醇、鄰氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸芐酯、芳樟醇的保留時間分別為4.967、10.537、11.406、11.797、14.189 min，理論塔板數(shù)均不低于15 000，各成分分離度均大于2，色譜峰形良好。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液色譜圖

2.3 線性方程與檢出限

取1.3.2 中的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2 色譜條件進樣測定，記錄各成分色譜峰面積，以溶液質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)、色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。取5 種香氣成分混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用甲醇逐級稀釋，在1.2 色譜條件下分別進樣測定，以3 倍信噪比時的質(zhì)量濃度作為方法檢出限，以10 倍信噪比時的質(zhì)量濃度作為定量限。5 種目標(biāo)物質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表1。

表1 5 種目標(biāo)物質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.4 精密度試驗

取同一批茉莉花純露樣品，按1.3.3 方法平行制備6 份樣品溶液，在1.2 色譜條件下分別進樣測定，結(jié)果見表2。由表2 可知，苯甲醇、鄰氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸芐酯及芳樟醇5 種目標(biāo)物測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.11%、0.41%、0.31%、0.62%、0.59%，表明該方法精密度良好。

表2 精密度試驗結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗

吸取1.3.3 中的樣品溶液10 μL，在1.2 色譜條件下，分別間隔0、5、10、14、18、24 h 進行測定，記錄5 種目標(biāo)物的色譜峰面積，結(jié)果見表3。由表3 可知，苯甲醇、鄰氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸芐酯和芳樟醇色譜峰面積測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.11%、1.05%、0.83%、0.69%、0.62%，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.6 加標(biāo)回收試驗

精密吸取已知含量的茉莉花純露樣品9 份，每份1.00 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，分別加入含苯甲醇0.157 1 mg/mL、鄰氨基苯甲酸甲酯0.108 3 mg/mL、吲 哚0.162 5 mg/mL、乙 酸 芐 酯0.637 4 mg/mL、芳樟醇0.252 8 mg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100、200、300 μL，用水定容至標(biāo)線，搖勻，配制成低、中、高3 種加標(biāo)質(zhì)量濃度水平的樣品溶液，在1.2色譜條件下分別進樣測定，結(jié)果見表4。由表4可知，5 種目標(biāo)物加標(biāo)回收率為97.13%～108.40%，表明該方法準(zhǔn)確度良好，滿足定量分析要求。

表4 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

3 結(jié)語

采用高效液相色譜法，以乙腈-水為流動相，梯度洗脫，選用Ultimate XB-C18色譜柱，建立了茉莉花純露中苯甲醇、鄰氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸芐酯和芳樟醇含量的檢測方法。該法專屬性強，精密度好，簡便可靠，可用于茉莉花純露的質(zhì)量控制和評價，為茉莉花純露質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供準(zhǔn)確、可靠的科學(xué)依據(jù)。