韓涵 綜述 何宇茜 張妍 審校

吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科中心角膜屈光科，長(zhǎng)春 130041

角膜是一種無(wú)血管的透明曲面結(jié)構(gòu)，提供了眼屈光系統(tǒng)約70%的屈光力。角膜包含5層結(jié)構(gòu)，由前向后依次為上皮細(xì)胞層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層。其中，角膜基質(zhì)層是角膜的主要結(jié)構(gòu)，是角膜透明性的主要提供者，含有以Ⅰ型膠原蛋白為主要結(jié)構(gòu)成分的膠原纖維、以小分子亮氨酸重復(fù)蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycans，SLRPs)為代表的蛋白聚糖和角膜基質(zhì)細(xì)胞等。SLRPs家族主要分為Ⅰ型(biglycan和decorin)、Ⅱ型(fibromodulin、keratocan和lumican)和Ⅲ型(osteoglycin)。生理狀態(tài)下，SLRPs家族成員間相互作用并與膠原蛋白相互作用，共同維持合適的膠原纖維直徑和纖維間距，在調(diào)控膠原纖維的形成、裝配和空間上的有序排列中起重要作用。此外，SLRPs還可以通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等細(xì)胞因子及其受體在角膜創(chuàng)傷修復(fù)和基質(zhì)重塑等病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。深入理解SLRPs在角膜透明性維持生理病理過(guò)程中的作用對(duì)于我們探索角膜透明性下降等疾病的治療手段具有重要意義。本文就生理病理狀態(tài)下SLRPs維持角膜透明的分子機(jī)制和SLRPs家族成員間的相互作用進(jìn)行綜述。

1.SLRPs家族成員及其生物學(xué)活性

SLRPs均由含有亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeats，LRRs)的同源核心蛋白和1～2個(gè)通過(guò)共價(jià)鍵與核心蛋白連接的糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)側(cè)鏈構(gòu)成。角膜基質(zhì)層中的SLRPs主要由角膜基質(zhì)細(xì)胞分泌，并依據(jù)GAG側(cè)鏈的類型主要分為3類，即含有硫酸皮膚素(dermatan sulfate，DS)的Ⅰ型SLRPs、含有硫酸角質(zhì)素(keratan sulfate，KS)的Ⅱ型和Ⅲ型SLRPs。SLRPs可通過(guò)GAG側(cè)鏈影響細(xì)胞生長(zhǎng)、結(jié)合水分子和生長(zhǎng)因子，調(diào)控基質(zhì)含水量以及膠原纖維的形成、裝配和排列，進(jìn)而維持角膜透明性；同時(shí)，核心蛋白中央?yún)^(qū)的LRRs也可幫助SLRPs與膠原蛋白、生長(zhǎng)因子及其細(xì)胞膜受體等蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，從而促進(jìn)SLRPs對(duì)角膜透明性的調(diào)節(jié)作用。

1.1 Ⅰ型SLRPs

1.1.1

結(jié)構(gòu)及分布 Decorin和biglycan均屬于Ⅰ型SLRPs，結(jié)構(gòu)包含10個(gè)LRRs和N端特異性絲氨酸序列(CXCXCXC)。在角膜發(fā)育階段，decorin和biglycan在角膜基質(zhì)層中均勻分布且含量均較高；在成熟角膜基質(zhì)層中，biglycan含量有所降低；而在角膜創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中，角膜基質(zhì)層中biglycan含量有所升高。

1.1.2

生物學(xué)活性 Decorin和biglycan在維持角膜基質(zhì)層膠原纖維的正常結(jié)構(gòu)和排列等方面發(fā)揮重要作用。Decorin缺失小鼠模型中角膜膠原纖維直徑增大、排列紊亂，角膜透明性明顯下降。此外，decorin可通過(guò)降低血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule,Pecam)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等促血管生成因子的表達(dá)，抑制角膜新生血管，提高角膜透明度。Biglycan與decorin存在補(bǔ)償性作用。在decorin缺失模型小鼠發(fā)育階段，角膜基質(zhì)層中biglycan的表達(dá)將會(huì)上升，可部分緩解因decorin缺失而產(chǎn)生的不良效應(yīng)；而在biglycan缺失模型小鼠發(fā)育階段，角膜基質(zhì)層decorin的表達(dá)量并未代償性升高，故推測(cè)decorin是膠原纖維形成的主要調(diào)節(jié)分子，而biglycan是補(bǔ)償性調(diào)節(jié)分子。因此，當(dāng)decorin缺失時(shí)，biglycan表達(dá)代償性升高；而當(dāng)decorin和biglycan均缺失時(shí)，會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)層膠原纖維直徑增大且形態(tài)不規(guī)則、基質(zhì)層后部纖維直徑增大和形態(tài)較前部更不規(guī)則等影響，膠原纖維堆積和基質(zhì)層的有序結(jié)構(gòu)受到破壞，影響角膜透明性的維持。在decorin缺失模型小鼠的成體階段，角膜透明性并未顯著下降，但會(huì)出現(xiàn)皮膚脆性增加、肌腱無(wú)力和氣道阻力降低等癥狀；而在biglycan水平較低的成年患者骨骼中，成骨細(xì)胞數(shù)量和活性均下降，易引起骨質(zhì)疏松癥等骨骼疾病，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，但這些患者的角膜并未出現(xiàn)異常。

1.2 Ⅱ型SLRPs

1.2.1

結(jié)構(gòu)及分布 Lumican、keratocan和fibromodulin均屬于Ⅱ型SLRPs，結(jié)構(gòu)包含10個(gè)LRRs和N端特異性絲氨酸序列(CXCXCXC)。胚胎發(fā)育階段及剛出生時(shí)，lumican和keratocan在角膜基質(zhì)層中分布均勻，fibromodulin主要分布在角膜表面和基質(zhì)層后部；成熟角膜中，lumican的表達(dá)被限制在角膜基質(zhì)層后部，而keratocan仍均勻分布于角膜基質(zhì)層，fibromodulin在基質(zhì)層中的表達(dá)減少，定位于角膜緣。

1.2.2

生物活性 Lumican在維持角膜透明等方面發(fā)揮重要作用。Chakravarti等對(duì)lumican缺失模型小鼠的角膜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)模型小鼠出生后透明角膜逐漸變混濁。Lumican缺失引起的膠原纖維直徑增大、排列紊亂等不良效應(yīng)主要局限在基質(zhì)層后部，這與角膜發(fā)育成熟過(guò)程中l(wèi)umican由均勻分布在角膜基質(zhì)層中逐漸變?yōu)閮H分布在基質(zhì)層后部相一致。進(jìn)一步對(duì)lumican缺失模型小鼠的角膜進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，lumican可通過(guò)改變自身表達(dá)模式使其僅在基質(zhì)層后部表達(dá)，從而把lumican缺失引起的小鼠角膜混濁限制于基質(zhì)層后部；同時(shí)，通過(guò)移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞至lumican缺失模型小鼠角膜基質(zhì)層后，角膜基質(zhì)層lumican表達(dá)增加，基質(zhì)層膠原纖維直徑變小、形態(tài)變規(guī)則，膠原纖維有序排列，角膜透明度有所恢復(fù)。此外，發(fā)育成熟過(guò)程中l(wèi)umican的GAG側(cè)鏈在酶催化下發(fā)生硫酸化，以促進(jìn)角膜透明性的形成。

在發(fā)育和成體階段，keratocan缺失可引起角膜基質(zhì)層變薄、基質(zhì)膠原纖維直徑輕度增大，可能與扁平角膜的發(fā)生有關(guān)，但其未對(duì)角膜透明性造成明顯影響。此外，在成年小鼠角膜中，keratocan僅在角膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，因此keratocan可以作為角膜基質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，用于角膜基質(zhì)的組織特異性啟動(dòng)子等遺傳靶點(diǎn)的操控。Fibromodulin與lumican有50%氨基酸序列相同，可與lumican競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Ⅰ型膠原蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)膠原纖維的成熟。Fibromodulin缺失可能會(huì)影響角鞏膜整合，但未對(duì)角膜透明性造成明顯影響。

Lumican與SLRPs其他家族成員間存在多種相互作用。Lumican與decorin以及biglycan間均存在協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)角膜膠原纖維結(jié)構(gòu)和空間排列。Lumican與fibromodulin間也存在補(bǔ)償作用。在fibromodulin缺失模型小鼠角膜中l(wèi)umican含量代償性升高；同時(shí)，lumican和fibromodulin均缺失的模型小鼠角膜基質(zhì)膠原纖維缺陷較僅lumican缺失模型小鼠更嚴(yán)重，推測(cè)二者還存在協(xié)同作用。人突變

lumican

轉(zhuǎn)基因模型小鼠角膜中biglycan、decorin和keratocan表達(dá)均下降，與圓錐角膜患者角膜中SLRPs的表達(dá)改變相類似，提示

lumican

基因突變可能與圓錐角膜相關(guān)。

1.3 Ⅲ型SLRPs

Osteoglycin屬于Ⅲ型SLRPs，主要定位于角膜上皮細(xì)胞、上皮基質(zhì)膜和基質(zhì)層的角膜基質(zhì)細(xì)胞中，其結(jié)構(gòu)包含6個(gè)LRRs和N端特異性絲氨酸序列(CXCXCXC)。在osteoglycin缺失小鼠的角膜發(fā)育階段，角膜結(jié)構(gòu)并不會(huì)出現(xiàn)明顯改變，角膜透明性也未受到明顯影響。Osteoglycin在角膜中的作用較小，但其在血管的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中發(fā)揮重要作用。Wang等研究發(fā)現(xiàn)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞敲除

osteoglycin

基因后，通過(guò)VEGF和VEGF受體2(VEGF receptor 2，VEGFR2)促進(jìn)細(xì)胞的增生和遷移。

2.SLRPs家族調(diào)控角膜膠原纖維正常排列

2.1 SLRPs調(diào)節(jié)角膜膠原纖維間的橫向排列

SLRPs在調(diào)節(jié)角膜膠原纖維間的橫向排列中發(fā)揮重要作用。缺乏SLRPs，尤其是decorin和lumican，將引起膠原纖維直徑增大、形態(tài)不規(guī)則，最終導(dǎo)致角膜透明度降低、混濁等癥狀。角膜膠原纖維橫向排列可分為六邊形網(wǎng)格和無(wú)定形網(wǎng)格，對(duì)于SLRPs如何調(diào)節(jié)膠原纖維橫向排列的分子機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。

2.1.1

SLRPs調(diào)控六邊形網(wǎng)格形成 Sawada等根據(jù)ECM中膠原纖維通過(guò)蛋白聚糖鏈與相鄰6條膠原纖維相連等觀察結(jié)果，提出定長(zhǎng)的蛋白聚糖鏈可以驅(qū)動(dòng)膠原纖維形成穩(wěn)定六邊形網(wǎng)格的機(jī)制。具體而言，膠原纖維表面存在的疏水力和靜電力可以驅(qū)動(dòng)相鄰且平行的膠原纖維聚集形成更粗的纖維，而SLRPs的核心蛋白可以屏蔽這2種力，從而抑制相鄰且平行的膠原纖維聚集形成化學(xué)鍵并形成更粗的纖維，防止角膜混濁。

2.1.2

SLRPs調(diào)控?zé)o定形網(wǎng)格形成 根據(jù)吉布斯-唐南效應(yīng)，SLRPs的GAG側(cè)鏈帶負(fù)電荷，可吸引帶正電荷的離子，使膠原纖維間的離子濃度增加，從而通過(guò)滲透作用吸引水分子進(jìn)入膠原纖維間，膠原纖維間過(guò)多的水分子會(huì)形成壓力，構(gòu)成膠原纖維間的排斥力；與此同時(shí)，連接2個(gè)或多個(gè)膠原纖維的GAG側(cè)鏈?zhǔn)軣狎?qū)動(dòng)而不能形成完全伸展的構(gòu)象，導(dǎo)致側(cè)鏈的末端緊密附著于膠原纖維上，從而提供膠原纖維間的吸引力；這2種相反的力最終會(huì)達(dá)到平衡，形成無(wú)定形網(wǎng)格，保證膠原纖維間的有序排列。相鄰膠原纖維間通過(guò)蛋白聚糖的結(jié)合是被不斷打破和重建的，該特性使角膜在結(jié)構(gòu)上富于流動(dòng)性，便于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物在角膜中的運(yùn)輸，并有利于角膜消除由外壓引起的彈性變形。

2.2 SLRPs調(diào)節(jié)膠原纖維間的縱向排列

膠原蛋白組裝形成膠原纖維前先與SLRPs形成復(fù)合物，復(fù)合物組裝形成兩端呈錐形的膠原纖維，膠原纖維表面覆蓋的SLRPs可抑制相鄰纖維間的側(cè)向聚合；由于表面覆蓋SLRPs的數(shù)量隨著膠原纖維直徑的減小而減少，導(dǎo)致纖維尖端的SLRPs數(shù)量較少，甚至沒(méi)有，因此膠原纖維易發(fā)生端對(duì)端融合，促進(jìn)纖維的縱向生長(zhǎng)。此外，隨著基質(zhì)中SLRPs的GAG側(cè)鏈電荷密度增加，端對(duì)端融合的概率也會(huì)增加，這對(duì)形成有序的膠原纖維間環(huán)境起誘導(dǎo)作用，促進(jìn)纖維的延長(zhǎng)。

3.SLRPs家族在角膜創(chuàng)傷修復(fù)中的作用機(jī)制

角膜創(chuàng)傷修復(fù)是一系列動(dòng)態(tài)級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程。首先，受損區(qū)的角膜基質(zhì)細(xì)胞迅速凋亡，部分基質(zhì)細(xì)胞壞死。然后，臨近受損區(qū)的基質(zhì)細(xì)胞增生、遷移，進(jìn)而轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞。角膜創(chuàng)傷修復(fù)是由多種細(xì)胞及細(xì)胞因子在時(shí)間、空間上高度協(xié)調(diào)完成的，其中SLRPs在這一過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

TGF-β是一種促纖維化細(xì)胞因子，生理狀態(tài)下，僅存在于角膜上皮；角膜損傷后TGF-β被釋放到基質(zhì)層，也可由肌成纖維細(xì)胞合成并分泌，加速炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)，但后期的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致ECM合成及降解失衡，引起角膜纖維化。相關(guān)研究表明，小鼠角膜損傷后對(duì)混濁有著更強(qiáng)的抵抗能力，這是因?yàn)榻悄せ|(zhì)層中decorin的表達(dá)具有種屬差異，相較于兔和人，小鼠角膜中decorin表達(dá)量更高，可以充分結(jié)合并中和TGF-β。通過(guò)基因療法或?qū)ecorin包埋入凝膠同樣可促進(jìn)角膜創(chuàng)傷小鼠或兔模型的無(wú)瘢痕修復(fù)。此外，decorin還可作為基質(zhì)層成纖維細(xì)胞細(xì)胞膜上表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的配體，與其形成復(fù)合物并通過(guò)細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷介導(dǎo)的內(nèi)吞作用降解EGFR，以抑制EGFR信號(hào)通路和成纖維細(xì)胞的遷移，從而調(diào)節(jié)角膜的創(chuàng)傷修復(fù)。

Lumican也在角膜創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。Lumican是目前唯一已知的在角膜創(chuàng)傷修復(fù)中由角膜上皮細(xì)胞表達(dá)的SLRPs。Lumican缺失模型小鼠角膜傷口愈合變慢，而重組lumican在整合素β1、局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)的介導(dǎo)下，促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞遷移，加速傷口愈合。同時(shí)，在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中，lumican被多種基質(zhì)金屬蛋白酶切割產(chǎn)生C端活性產(chǎn)物，該活性產(chǎn)物通過(guò)結(jié)合TGF-β受體1促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的增生和遷移。此外，在角膜基質(zhì)層中，lumican可通過(guò)激活Fas/Fas配體系統(tǒng)增強(qiáng)基質(zhì)細(xì)胞凋亡，以調(diào)控角膜創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程。

4.SLRPs家族在角膜基質(zhì)重塑中的作用機(jī)制

角膜基質(zhì)創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中基質(zhì)細(xì)胞的死亡、促纖維化細(xì)胞因子和炎癥因子的釋放、中性粒細(xì)胞等的招募和ECM降解酶的產(chǎn)生等事件共同導(dǎo)致基質(zhì)重塑。在角膜基質(zhì)重塑的發(fā)生中，SLRPs可通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的過(guò)程發(fā)揮調(diào)控作用。

在角膜基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的過(guò)程中，會(huì)喪失keratocan和lumican等的分泌功能，且肌成纖維細(xì)胞會(huì)大量產(chǎn)生含有biglycan、排列紊亂、過(guò)度壓縮的異?；|(zhì)，這些異常基質(zhì)沉積在角膜基質(zhì)層中，導(dǎo)致基質(zhì)重塑。由于decorin還可通過(guò)與TGF-β形成復(fù)合體或競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TGF-β受體，以降低TGF-β的生物利用率，從而抑制瘢痕形成和減輕角膜混濁，因此基因轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)decorin可抑制TGF-β誘導(dǎo)的基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和基質(zhì)重塑。

5 小結(jié)與展望

SLRPs作為角膜的重要組成部分，在維持角膜膠原纖維的正常排列、創(chuàng)傷修復(fù)和基質(zhì)重塑等過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。SLRPs家族成員間存在補(bǔ)償作用和協(xié)同作用，但是SLRPs家族成員間的相互作用和SLRPs調(diào)節(jié)膠原纖維橫向、縱向排列的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。SLRPs與角膜創(chuàng)傷修復(fù)和基質(zhì)重塑等多種病理過(guò)程相關(guān)，通過(guò)研究以decorin和lumican為代表的SLRPs與表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、TGF-β等細(xì)胞因子及其受體的相互作用、下游信號(hào)通路對(duì)于深入認(rèn)識(shí)角膜相關(guān)疾病具有重要意義，為相關(guān)臨床治療提供理論依據(jù)。

利益沖突

所有作者均聲明不存在利益沖突