液基細胞學、DNA倍體及熒光原位雜交對上尿路尿路上皮癌的診斷價值

王富申，劉秋禮，楊 新，張 軍，張 堯，蘭衛(wèi)華，王洛夫，江 軍

400042 重慶，陸軍特色醫(yī)學中心：泌尿外科1，病理科2

上尿路尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma，UTUC)是發(fā)生于腎盂或輸尿管尿路上皮的惡性腫瘤中最常見的一種病理類型，在歐美人群中其發(fā)病率占所有尿路上皮癌的5%～10%；而在國人中占9.3%～29.9%。雖然UTUC比膀胱癌發(fā)病率低，但由于其發(fā)生于腎盂或輸尿管的狹小腔道內，加之部分病例又缺乏典型臨床表現(xiàn)，增加了UTUC發(fā)病早期的隱匿性，容易被忽視或漏診，導致在初次診斷時的臨床分期比膀胱癌晚，54.0%～65.9%已發(fā)展為肌層浸潤階段，手術治療后復發(fā)、轉移風險高，影響患者長期生存。因此，早期發(fā)現(xiàn)與診斷對于UTUC的治療及預后至關重要。

目前UTUC的診斷主要是基于輸尿管鏡檢+活檢、影像學、尿液基細胞學。輸尿管鏡檢+活檢是治療前明確診斷的重要方式，不僅能在鏡下觀察上尿路的具體情況，還能取樣獲得組織病理學依據(jù)；但該方式存在以下問題：①有創(chuàng)，對于非癌患者術后可能導致粘連狹窄；②對于上尿路存在解剖變異或尿路重建史時鏡檢困難；③可能因活檢樣本較小而出現(xiàn)假陰性結果；④有增加根治性腎輸尿管切除術后膀胱內復發(fā)的風險。因此，目前輸尿管鏡檢+活檢在UTUC診斷中的應用有一定爭議。影像學主要包括CTU及MRU，盡管敏感性較高，但容易遺漏微小及扁平腫瘤，并且對于軟組織病變的定性診斷存在一定局限，也缺乏病理學依據(jù)。尿液基細胞學是基于細胞形態(tài)學的病理診斷，最大優(yōu)勢為相對簡單、無創(chuàng)，同時診斷特異性高(80%～100%)，但是其診斷敏感性受病理醫(yī)師主觀經驗等因素影響，在各個中心間存在差異，為21%～80%；因此，相當一部分尿液基細胞學陰性患者存在漏診風險。

DNA倍體分析是通過測定細胞DNA含量或倍體來評估是否為腫瘤；既往已有較多研究將DNA倍體分析應用于宮頸癌、肺癌、膀胱癌等腫瘤的診斷中，但DNA倍體應用于UTUC檢測中研究較少，國內3項小樣本研究報道的敏感性為60.0%～77.1%，特異性為95.5%～100.0%。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)作為另外一種無創(chuàng)的檢查手段，是根據(jù)細胞染色體變異來判斷是否為腫瘤；在臨床應用中表現(xiàn)出了可觀的敏感性(52%～100%)與特異性(33%～96%)；多數(shù)研究指出其敏感性優(yōu)于液基細胞學，特異性與液基細胞學相當，國內指南也將FISH列為在有條件單位可選擇的UTUC的輔助診斷手段?；谝陨蠁栴}，本研究采用本單中心UTUC患者數(shù)據(jù)，分析基于尿液無創(chuàng)的液基細胞學、DNA倍體及FISH在UTUC患者中單獨及聯(lián)合診斷的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

連續(xù)納入本中心2013年1月至2021年6月影像學可疑UTUC的患者，排除合并膀胱癌、術前3個月內無尿液基細胞學、無組織病理檢測結果者。共納入246例患者，其中組織病理證實為UTUC 190例、非腫瘤病變43例、其他類型腫瘤13例；246例均有自然排尿標本的液基細胞學結果，其中178例有DNA倍體分析結果、167例有FISH結果，11例同時有腎盂輸尿管沖洗尿的液基細胞學結果；納入患者均行CT、MRI或膀胱鏡排除膀胱癌。本研究經本單位倫理委員會審核通過[醫(yī)研倫審(2018)第96號]。

1.2 診斷方法及結果判定

1.2.1 標本制作 收集患者清晨清潔中段尿液約100 mL,將尿液倒入離心管內，將尿樣離心后棄上清液，在沉淀內加入適量緩沖液后得到細胞懸液；取部分細胞懸液，采用沉降式液基薄層技術制成1張薄層細胞片，用于HE染色進行細胞學檢查；另取部分細胞懸液采用涂片離心機制成1張薄層細胞片，用于DNA染色程序(Feulgen 染色法)，然后用細胞DNA定量自動分析系統(tǒng)(武漢蘭丁醫(yī)學高科技有限公司)對玻片進行掃描。收集患者清晨清潔中段尿約200 mL，經反復離心、沖洗及固定液固定后，采用北京金普嘉醫(yī)療科技有限公司提供的FISH DNA探針和DAPI復染劑進行原位雜交及復染后在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.2.2 液基細胞學診斷結果分為4類，Ⅰ類：未見腫瘤細胞，Ⅱ類：查見少量異型細胞，Ⅲ類：查見可疑癌細胞，Ⅳ類：查見癌細胞，其中以Ⅳ類為陽性，Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類為陰性。

1.2.3 DNA倍體分析所有Feulgen染色片用DNA定量自動分析系統(tǒng)進行掃描處理，系統(tǒng)可對每張玻片上6 000個以上細胞核進行掃描測定，經掃描后的每個細胞核均有123個特征值，系統(tǒng)根據(jù)不同細胞成分所具有的不同特征來完成自動細胞分類和計數(shù)。以正常尿路上皮細胞為對照，所測出的平均光密度為2C的參考值，計算各個細胞的DNA含量，并以DNA指數(shù)(DI)表示，DI=DNA含量/2。正常細胞DI值多為1左右，增生細胞或疑似癌變細胞1

1.2.4 FISH計數(shù)信號包括CSP3(綠色)、CSP7(紅色)、CSP17(綠色)、GLP16(紅色)，計數(shù)100個細胞，正常細胞各個探針均可見2個信號，異常信號在3號、7號、17號染色體主要表現(xiàn)為多體(CSP3、CSP7及CSP17信號≥3個)，在GLP16主要表現(xiàn)為缺失(GLP16信號≤1個)，檢測指標大于等于閾值(CSP3、CSP7、CSP17、GLP16≥15%)，則認為該單項探針陽性；在CSP3、CSP7及CSP17中出現(xiàn)至少2個探針陽性、或者出現(xiàn)單獨GLP16陽性則判定為FISH陽性，否則視為陰性。

1.2.5 組織病理 以組織病理結果為金標準，活檢或外科切除手術中所獲取的組織標本行HE染色觀察，以尿路上皮癌為陽性，非腫瘤病變?yōu)殛幮?。UTUC分級參考WHO2004版標準，分期參考UICC2017版標準。

1.3 統(tǒng)計學分析

分別計算液基細胞學、DNA倍體及FISH三者單獨及聯(lián)合后的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值。敏感性=真陽性/(真陽性+假陰性)，是在組織病理診斷為UTUC的患者中，經診斷試驗檢測為陽性者所占的比例；特異性=真陰性/(真陰性+假陽性)，是在組織病理診斷為非腫瘤病變的患者中，經診斷試驗檢測為陰性者所占的比例；陽性預測值=真陽性/(真陽性+假陽性)，是在診斷試驗檢測為陽性的患者中，經組織病理診斷為UTUC者所占的比例；陰性預測值=真陰性/(真陰性+假陰性)，是在診斷試驗檢測為陰性的患者中，經組織病理診斷為非腫瘤病變者所占的比例。采用χ檢驗比較不同檢測方法敏感性差異，采用χ檢驗比較三者聯(lián)合(任一陽性)與細胞學單獨診斷的特異性差異；采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC曲線)進行關聯(lián)分析。使用SPSS23.0統(tǒng)計軟件，不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)M(Q1～Q3)表示，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 246例患者臨床特征

共納入246例影像學可疑UTUC患者，包含190例尿路上皮癌、43例非腫瘤和13例其他類型腫瘤；各組患者臨床特點見表1。在43例非腫瘤患者中，以輸尿管炎性狹窄最為多見，有26例；在13例其他類型腫瘤中以原發(fā)于腎盂的腫瘤多見，有6例；見表2。

表1 246例患者一般臨床資料[M(Q1～Q3)，例數(shù)(%)]

臨床特征尿路上皮癌(n=190)非腫瘤(n=43)其他類型腫瘤(n=13)年齡/歲67(58～75)45(38～61)63(48～68)性別 男126(66.3)13(30.2)9(69.2) 女64(33.7)30(69.8)4(30.8)臨床癥狀 無痛肉眼血尿127(66.8)8(18.6)5(38.5) 血尿伴腰腹部疼痛20(10.6)4(9.3)0(0.0) 腰腹部疼痛26(13.7)24(55.8)5(38.5) 無/其他17(8.9)7(16.3)3(23.0)腎積水 有127(66.8)36(83.7)11(84.6) 無63(33.2)7(16.3)3(15.4)腫瘤/病變位置 腎盂/腎臟107(56.3)7(16.3)8(61.5) 腎盂及輸尿管15(7.9)2(4.7)a0(0.0) 輸尿管68(35.8)34(79.0)5(38.5)病理分級 低級別28(14.7) 高級別162(85.3)病理分期 Ta17(8.9) T157(30.0) T234(17.9) T375(39.5) T47(3.7)

a:2例為腎盂輸尿管連接部梗阻(ureteropelvic junction obstruction，UPJO)

表2 非UTUC患者組織病理類型

組織病理類型例數(shù)非腫瘤病例43 輸尿管炎性狹窄26 輸尿管子宮內膜異位癥2 輸尿管息肉5 UPJO2 腎囊腫伴出血3 輸尿管結核1 腎海綿狀血管瘤1 節(jié)段性腎埂死1 腎積膿1 腎盂黏膜炎性增生1其他類型腫瘤病例13 腎盂鱗癌2 腎盂/輸尿管腺癌2a 腎盂肉瘤化癌1 腎盂軟組織肌上皮癌1 輸尿管平滑肌肉瘤1 輸尿管轉移性腺癌3 腎盂黏膜下平滑肌瘤1 腎細胞癌2

a:腎盂及輸尿管腺癌各1例

2.2 三種診斷方法單獨及聯(lián)用的準確性評價及比較

自然排尿標本的液基細胞學、DNA倍體及FISH的敏感性分別為：44.7%、82.2%、57.9%，特異性分別為97.7%、82.4%、92.3%，陽性預測值分別為：98.8%、94.9%、97.5%，陰性預測值分別：28.6%、53.9%、30.0%。將液基細胞學與FISH聯(lián)合診斷(兩者任一陽性)，敏感性為75.2%；將液基細胞學與DNA倍體聯(lián)合診斷(兩者任一陽性)，敏感性為85.9%；將DNA倍體與FISH聯(lián)合診斷(兩者任一陽性)，敏感性為92.8%；再將三種方法聯(lián)合診斷(三者任一陽性)，敏感性為93.8%，見表3。三者聯(lián)合后的敏感性與單獨液基細胞學比較，χ=65.214，

P

<0.001，與單獨DNA倍體比較，χ=6.737，

P

=0.009，與單獨FISH比較，χ=36.755，

P

<0.001，差異均有統(tǒng)計學意義。三種方法對不同病理分級的UTUC的敏感性比較，液基細胞學、DNA倍體及FISH對于高級別UTUC的敏感性分別為：48.1%、87.7%、60.7%，均高于低級別UTUC，對應P值分別為：0.023、

P

<0.001、0.078，見表4。UTUC患者中有7例自然排尿的液基細胞學結果雖為陰性，但通過取腎盂輸尿管沖洗尿樣，再次行液基細胞學檢查，其中2例結果為陽性；在我們非腫瘤病例中有4例自然排尿的液基細胞學結果為陰性，但因結合影像仍懷疑UTUC，也采集了腎盂輸尿管沖洗尿樣再次行液基細胞學檢查，結果均為陰性。盡管三者聯(lián)合(任一陽性)可提高診斷敏感性，但同時導致其診斷特異性下降至76.2%,與液基細胞學單獨使用時比較，χ=5.345，

P

=0.021。我們將任意兩者同時陽性作為診斷UTUC的標準(兩者均陰性或僅一者陽性視為陰性)時，這種聯(lián)合診斷方法的陽性預測值及特異性均為100%。詳見表5。

表3 三種檢查方法單獨及聯(lián)合(任一陽性)診斷的準確性評價及比較

檢查方法敏感性特異性陽性預測值陰性預測值液基細胞學44.7%(85/190)a97.7%(42/43)a98.8%(85/86)28.6%(42/147)FISH57.9%(77/133)a92.3%(24/26)97.5%(77/79)30.0%(24/80)DNA倍體82.2%(111/135)a82.4%(28/34)94.9%(111/117)53.9%(28/52)液基細胞學+FISH75.2%(100/133)88.5%(23/26)97.1%(100/103)41.1%(23/56)液基細胞學+DNA倍體85.9%(116/135)79.4%(27/34)94.3%(116/123)58.7%(27/46)FISH+DNA倍體92.8%(90/97)81.0%(17/21)95.7%(90/94)70.8%(17/24)液基細胞學+FISH+ DNA倍體93.8%(91/97)76.2%(16/21)94.8%(91/96)72.7%(16/22)

a: <0.05，與液基細胞學+FISH+DNA倍體比較

表4 三種方法對不同分級UTUC的敏感性及比較

檢查方法低級別高級別χ2值P值液基細胞學25.0%(7/28)48.1%(78/162)5.1740.023FISH37.5%(6/16)60.7%(71/117)3.1030.078DNA倍體52.4%(11/21)87.7%(100/114)12.829<0.001

表5 任意兩種方法聯(lián)合診斷(同時陽性)的準確性評價

檢查方法敏感性特異性陽性預測值陰性預測值液基細胞學+FISH30.8%(41/133)100.0%(26/26)100.0%(41/41)22.0%(26/118)液基細胞學+DNA倍體48.9%(66/135)100.0%(34/34)100.0%(66/66)33.0%(34/103)FISH+DNA倍體49.5%(48/97)100.0%(21/21)100.0%(48/48)30.0%(21/70)

本研究86例液基細胞學檢查陽性患者中有1例假陽性，組織病理為輸尿管炎性狹窄，DNA倍體及FISH均陰性；79例FISH陽性患者中有2例假陽性，組織病理分別為左腎節(jié)段性梗死、右腎海綿狀血管瘤，均為單獨P16缺失，液基細胞學及DNA倍體均陰性。117例DNA倍體陽性患者中有6例假陽性，組織病理分別為2例輸尿管息肉、2例輸尿管炎性狹窄、1例腎盂黏膜炎性增生、1例UPJO，異倍體細胞數(shù)目均較少(1～8個)，6例患者液基細胞學均陰性，2例患者FISH陰性，另外4例缺乏FISH結果。將DNA異倍體細胞數(shù)目與是否為UTUC進行關聯(lián)分析，采用ROC曲線取最佳閾值，曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.876，見圖1，最大約登指數(shù)(66.0%)對應的閾值≥2.5個異倍體細胞，敏感性為74.8%，特異性為91.2%。

2.3 其他類型腫瘤的檢出情況

在其他類型的上尿路腫瘤中有3例液基細胞學陽性，組織病理證實為2例腎細胞癌和1例輸尿管轉移性腺癌；有6例DNA倍體陽性，組織病理證實為2例輸尿管轉移性腺癌、1例腎盂鱗癌、1例腎盂軟組織肌上皮癌、1例腎細胞癌及1例腎盂黏膜下平滑肌瘤；有1例FISH陽性，組織病理證實為黏膜下平滑肌瘤。

3 討論

尿液基細胞學作為一種液態(tài)活檢方式，因無創(chuàng)便捷及特異性高的特點，是診斷UTUC的基石性檢查之一，但是其敏感性較低；如何增加UTUC診斷敏感性一直是臨床研究熱點。本研究采用液基細胞學、DNA倍體及FISH三種方法分別從細胞的形態(tài)學、生物學行為和分子學特征等方面多角度綜合評估，擬探討增加診斷UTUC的敏感性。結果發(fā)現(xiàn)三種方法對UTUC的特異性均較高，敏感性均較低，對UTUC均有一定診斷價值；將三者聯(lián)合(任一陽性)后，對UTUC的檢測敏感性提升至93.8%，相較于三者單獨使用均得到了顯著提高，有助于降低漏診率。此外，將任意兩者同時陽性作為診斷UTUC的標準(兩者均陰性或僅一者陽性視為陰性)時，其陽性預測值及特異性均為100%。說明采用三者中同時有兩者陽性的標準去確診UTUC有助于降低誤診率。通過三者的聯(lián)合能提高UTUC診斷的準確性，這對于指導UTUC的臨床治療有重要意義。

UTUC術前獲得準確的病理診斷是目前臨床面臨的難點，雖然輸尿管鏡活檢可為診斷提供幫助，但受限于其敏感性及術后易導致種植轉移等問題，其在UTUC診斷中的應用仍受爭議。目前國內外各大指南均強烈推薦所有可疑UTUC常規(guī)行尿液基細胞學檢查，多數(shù)研究報道的敏感性較低，為25.9%～59.0%。導致敏感性較低的可能原因如下：①診斷時脫離了組織背景，形態(tài)學上較難客觀判斷，敏感性受病理醫(yī)師的主觀經驗影響較大。本研究將DNA倍體和FISH與液基細胞學有機整合，減少形態(tài)學主觀判斷影響，發(fā)現(xiàn)可明顯提高UTUC診斷敏感性。SUN等研究發(fā)現(xiàn)將液基細胞學與FISH聯(lián)合后檢測UTUC的敏感性可達85.2%；SASSA等的研究也提示FISH可提高液基細胞學對UTUC的診斷敏感性，提升至65.9%。此外，蘇杰等、趙雪等研究指出：DNA倍體分析在診斷UTUC時的敏感性高于液基細胞學，兩者任一陽性的聯(lián)合方式能提高液基細胞學對UTUC診斷的敏感性，但并不明顯優(yōu)于DNA倍體單獨診斷敏感性。上述研究僅探討了DNA倍體和FISH分別聯(lián)合液基細胞學對UTUC診斷敏感性影響，而本研究通過回顧性分析將3項指標聯(lián)合診斷(任一陽性)，評估其在UTUC診斷中意義，其將UTUC診斷敏感性提升至93.8%，明顯高于液基細胞學與其中一者聯(lián)合結果。②低級別腫瘤的粘附性較好不易脫落、分化高異型性較小不易鑒別導致其敏感性較低，與既往研究一致，本研究也發(fā)現(xiàn)無論液基細胞學、DNA倍體還是FISH，對高級別UTUC的診斷敏感性均更高。③由UTUC病灶導致的上尿路梗阻可能會限制癌細胞隨尿液排出；本研究發(fā)現(xiàn)腎盂輸尿管沖洗尿行細胞學檢查可增加敏感性，其中7例自然排尿樣本液基細胞學陰性的UTUC患者采集了腎盂輸尿管沖洗尿樣行液基細胞學檢查后，發(fā)現(xiàn)其中2例陽性。研究也證實通過膀胱鏡下輸尿管插管或者輸尿管鏡檢過程中沖洗取樣的方式有利于增加UTUC的檢出。

雖然三者在診斷UTUC時特異性均較高，但每種方法均存在假陽性發(fā)生。首先，本研究發(fā)現(xiàn)液基細胞學診斷特異性為97.7%，與葉烈夫等的研究結果相近；本研究中液基細胞學含有1例假陽性，組織病理為輸尿管炎性狹窄，該患者術前合并尿膿毒血癥，影像學查見右側輸尿管上段管壁明顯增厚伴強化，導致管腔明顯狹窄，輸尿管鏡檢+活檢后行尿液基細胞學發(fā)現(xiàn)陽性；導致假陽性原因可能與輸尿管鏡機械操作或感染相關，BIER等也有相關報道。其次，本研究發(fā)現(xiàn)DNA倍體特異性為82.4%，與蘇杰等研究結果相比較低。本研究DNA倍體分析存在6例假陽性病例，這些病例異倍體細胞數(shù)目均較少，僅1～8個，因而異倍體細胞數(shù)目較少可能與DNA倍體假陽性密切相關。本研究對異倍體細胞數(shù)目與UTUC診斷敏感性和特異性進行ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)在異倍體細胞數(shù)目為3個時的約登指數(shù)最大，對應的敏感性為74.8%，特異性為91.2%；而佘東立等研究指出將DNA倍體分析陽性閾值設定為DNA指數(shù)(DI值)2.3，異倍體細胞比例9‰或10‰時診斷效果最好，敏感性為59%，特異性為95%。最后，本研究發(fā)現(xiàn)FISH診斷特異性是92.3%，較SASSA等研究報道的特異性高。本研究中2例FISH假陽性患者均表現(xiàn)為單獨P16缺失，與SASSA等研究結論一致，單獨P16缺失與FISH假陽性密切相關，主要因為P16缺失也可能出現(xiàn)在正常的尿路上皮細胞中。此外，發(fā)病年齡也與假陽性密切相關，在本研究9例假陽性患者中，8例患者較年輕(27～55歲)，不在UTUC的高發(fā)年齡段內(60歲以上)。總之，在面對異倍體細胞數(shù)目少、FISH為單獨P16缺失、患者較年輕等情況時，假陽性的風險相對較大；為避免假陽性發(fā)生，本研究也發(fā)現(xiàn)將液基細胞學、DNA倍體和FISH中任意兩者同時陽性作為診斷UTUC的標準時，陽性預測值及特異性均為100%。與趙雪等、SASSA等結果一致。

除了本研究分析的3個因素外，其他基于尿液的檢測方式還包括膀胱腫瘤抗原(BTA)、核基質蛋白22(NMP22)、免疫細胞檢查(ImmunoCyt)、DNA甲基化修飾、尿液游離DNA的基因突變等。既往研究也顯示這些方法單獨或綜合檢測都能對UTUC的診斷有所幫助，但確切的臨床應用價值尚存爭議，這些也值得我們下一步進行探討。

綜上所述，尿液基細胞學、DNA倍體和FISH對UTUC均有一定診斷價值，三者結合可有效提高診斷的敏感性或特異性，但具體臨床應用需結合患者臨床特點、影像特征等多因素綜合評估，從而給出個性化診治，降低漏診或誤診風險。因本研究屬于回顧性，并且樣本量有限，所得結論有待于前瞻性、大樣本研究進一步驗證。