吳美艷 羅興錄,2* 劉珊廷 樊鑄硼 黃堂偉 楊燕妮

(1.廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，南寧 530005；2.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004)

木薯(Cassava)屬于大戟科木薯屬，與馬鈴薯和甘薯并列世界三大薯類作物。我國種植木薯的產(chǎn)區(qū)分布在熱帶地區(qū)。木薯塊根不僅淀粉含量高，而且富含大量膳食纖維，可食用、飼用并用于工業(yè)開發(fā)。木薯細(xì)菌性枯萎病(Cassava bacterial blight,以下簡稱CBB)又稱細(xì)菌性萎蔫病，是受地毯草黃單胞菌(

Xanthomonas

axonopodis

pv.

manihotis

)侵染木薯葉片、莖稈，出現(xiàn)萎蔫，甚至死亡的病害。該病害可使木薯減產(chǎn)12%～90%，嚴(yán)重制約了我國木薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，亟待開展木薯抗細(xì)菌性枯萎病的研究，實現(xiàn)木薯的高產(chǎn)增收。

病原物侵入后植物，植物在組織結(jié)構(gòu)、生理生化上產(chǎn)生一系列反應(yīng)，其中參與各種代謝活動的防御酶活性變化最為活躍，防御酶活性變化情況與植物抗病性關(guān)系密切。PAL 是一種苯丙烷類代謝定速酶，也是苯丙烷類代謝途徑起催化作用的關(guān)鍵酶和限速酶。POD和PPO參與植物體內(nèi)酚類物質(zhì)和木質(zhì)素的合成，是植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)的主要保護酶，二者協(xié)同作用可抵抗活性氧對植物細(xì)胞造成的傷害，與植物的抗病性有重要關(guān)系。SOD 作為植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)重要保護酶之一，能清除超氧化物陰離子自由基，提高植物抗逆性。CAT 催化 HO分解為 HO和O，能清除植物體內(nèi)過量的 HO，從而將 HO維持在正常水平。李伯凌等對細(xì)菌性枯萎病的研究表明木薯葉片接種后，葉片中的POD活性與木薯的抗病性呈正相關(guān)。樊春俊等研究木薯對細(xì)菌性枯萎病抗性與防御酶活性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)對細(xì)菌性枯萎病抗性不同的木薯品種的POD活性有差異。陳亮等在研究西瓜葉片與枯萎病之間的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)高抗西瓜品種葉片的SOD、POD、PPO、CAT等酶活性較未接種顯著增加。雖然針對植物感病后防御酶變化規(guī)律的研究的報道不少，但是對木薯感病后防御酶活性變化規(guī)律的研究尚少。因此，本試驗擬以‘GR891’和‘新選048’為研究對象，采用噴霧法接種自然發(fā)病，根據(jù)病斑大小、病情分級等鑒定木薯抗病性，劃分抗木薯細(xì)菌性枯萎病等級，分析健康和感病植株葉片5 種酶SOD、PAL、POD、CAT和PPO活性，同時比較2 種木薯品種的葉片酶活性與細(xì)菌性枯萎病的抗性關(guān)系，以期為控制該病害擴展蔓延提供生理生化方面的理論依據(jù)，旨在為‘GR891’和‘新選048’2 個木薯品種在實際應(yīng)用生產(chǎn)中提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株為廣西北海市合浦縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗基地采集具有細(xì)菌性枯萎病癥狀的病葉，由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院分離鑒定的Cax-03。

供試木薯品種分別為廣西熱帶作物研究所培育的‘GR891’和廣西大學(xué)木薯課題組培育的‘新選048’2個木薯品種。

1.2 接種及取樣

于2018年3月廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院綜合樓后試驗地進行桶栽，每個大桶內(nèi)種植2株木薯種莖，在8月份木薯的塊根形成期選用分離出的Cax-03的菌株接種木薯葉片。

將菌株Cax-03的菌液在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上涂布，28 ℃倒置培養(yǎng)48 h，挑取一個單菌落放入150 mL的三角瓶，在130 r/min、28 ℃的搖床上搖12 h，配制成3.0×10CFU/mL(OD=0.6)菌懸浮液。選擇生長良好、葉齡一致的完好復(fù)葉進行接種，主要采用木薯的第5片完全展開葉進行接種，以滅過菌的液體培養(yǎng)基為對照CK。CK1表示‘GR891’噴霧接種法滅過菌的液體培養(yǎng)基(對照組)、T1表示‘GR891’噴霧法接種Cax-03菌液(試驗組)、CK2表示‘新選048’噴霧法接種滅過菌的液體培養(yǎng)基(對照組)、T2表示‘新選048’噴霧法接種Cax-03菌液(試驗組)。接種完后用潔凈干燥的塑料袋對接種葉片進行套袋保溫保濕24 h。在接種后的第7天和第14天分別采集木薯中上部的功能葉片，混合后液氮速凍，于-80 ℃低溫冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆?，用于測定各酶活指標(biāo)。

1.3 測定項目及方法

1

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3

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1

防御性酶活測定方法

PAL活性采用分光光度法測定；SOD活性采用氮藍(lán)四唑光化還原法測定；POD活性采用愈創(chuàng)木酚比色法；PPO活性測定采用碘滴定法；CAT活性測定采用紫外吸收法。

1

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3

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2

木薯病情指數(shù)評估

本次試驗對接種木薯的病情等級主要根據(jù)岑貞陸等和李伯凌等的方法來劃分，具體劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：

0級：葉片無明顯病斑，接種點沒有發(fā)病

1級：在葉片上可看到有水漬狀病斑，病斑長度<0.5 cm

3級：病斑長度0.6～1.5 cm

5級：病斑長度1.6～2.5 cm

7級：病斑長度2.6～4.0 cm

9級：葉片發(fā)病嚴(yán)重，葉片萎蔫或脫落，病斑長度>4.0 cm。

感病評價接種 12 d后測量病斑大小，病情指數(shù)計算公式如下：

病情指數(shù)

根據(jù)病情指數(shù)劃分抗病水平：高抗在10以內(nèi)；中抗20～30；感病30～40；中感40～60；高感60以上。

1.4 統(tǒng)計分析

用Microsoft Excel 2007軟件進行原始數(shù)據(jù)整理、分析、作表、作圖，用 SPSS 18.0 軟件進行方差分析或其他統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2個木薯品種對細(xì)菌性枯萎病的抗性比較

對桶栽的‘GR891’和‘新選048’2個木薯品種進行噴霧法接種之后，調(diào)查木薯葉片的病情，結(jié)果見表1?？芍骸瓽R891’的病情等級為3級；‘新選048’病情等級為1級，‘GR891’比‘新選048’的病情指數(shù)高，‘GR891’的病情指數(shù)為43.7，表現(xiàn)為中感，‘新選048’的病情指數(shù)為29.4，表現(xiàn)為中抗。因此，‘新選048’對細(xì)菌性枯萎病的抗性更強。

表1 接種12 d 2個木薯品種的病情指數(shù)比較

Table 1 Comparison of disease index of 2 cassava varieties inoculated for 12 days

木薯品種Variety病斑長度/cmLesionlength病情指數(shù)DiseaseinfectedindexGR8910.6±0.2aA43.7新選048XX0480.3±0.1bB29.4

注：同列數(shù)據(jù)小寫字母和大寫字母分別表示‘GR891’和‘新選048’在<0.05和<0.01水平上差異顯著。下同。

Note: Values marked with lowercase letters and uppercase letters within the same column indicate that the‘GR891’ and ‘Xinxuan048’are significantly different at the levels of <0.05 and <0.01, respectively.The same below.

2.2 侵染條件下木薯葉片防御酶活性的比較

2

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2

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1

PAL活性變化

不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的PAL活性比較見表2?？芍臃N病原菌后，2個木薯品種之間存在著差異。接種第7天的對照CK1的PAL活性低于處理T1，處理T2的PAL活性低于CK1;接種第14天后，處理T1低于對照CK1，處理T2高于對照CK2。接種第2天到第14天，處理T1的PAL酶活性下降了30.17%，處理T2的PAL酶活性上升了6.54%。接種第7天，各處理間無明顯差異；接種第14天后，對照CK1和處理T1之間差異極顯著，對照CK2和處理T2無明顯差異。

表2 不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的PAL活性比較

Table 2 Comparison of PAL activity between diseased leaves and healthy leaves of different cultivars

處理Treatment第7天Day7第14天Day14CK111.75aA13.19aAT113.06aA9.12bBCK213.40aA12.39aAT212.57aA13.45aA

注：CK1，‘GR891’噴霧法接種滅過菌的液體培養(yǎng)基(對照組)；T1，‘GR891’噴霧法接種Cax-03菌液(試驗組)；CK2，‘新選048’噴霧法接種滅過菌的液體培養(yǎng)基(對照組)；T2，新選048’噴霧法接種Cax-03菌液(試驗組)。下同。

Note: CK1,‘GR891’ spray inoculation of sterilized liquid medium(control group); T1,‘GR891’ spray inoculation of Cax-03 bacterial liquid(test group); CK2,‘Xinxuan048’ spray inoculation of sterilized liquid medium(control group); T2, ‘Xinxuan048’ spray inoculation of Cax-03 bacterial liquid(test group).The same below.

2

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2

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2

SOD活性變化

不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的SOD活性比較見表3。可知：接種細(xì)菌性枯萎病病原菌后，2 個木薯品種在葉片SOD活性無明顯變化。在接種第7天，對照CK1和處理T1之間顯著差異，對照CK2和處理T2之間差異顯著；接種第7天和接種第14天，2個品種的對照CK與處理T之間都無顯著差異。這說明，接種細(xì)菌性枯萎病病原菌后，對木薯葉片的SOD活性影響不大。

表3 不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的SOD活性比較

Table 3 Comparison of SOD activity between diseased leaves and healthy leaves of different cultivars

處理Treatment第7天Day7第14天Day14CK1474.34aA470.11aAT1487.45aA465.68aACK2425.40bB506.54aAT2462.20aAB501.84aA

2

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2

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3

CAT活性變化

不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的CAT活性比較見表4?？芍航臃N細(xì)菌性枯萎病病原菌14天后，2個木薯品種葉片的CAT活性都是隨著時間的增加而增加，處理T2的CAT活性上升程度最明顯。其中：處理T2的CAT酶活性比處理第7天時增加了72.31%；處理T1的CAT酶活性增加了34.2%;沒有接種病原菌的對照CK變化不大。接種第7天，處理T1的CAT活性達到最高，為50.59 U/(g·min)，與其他3個處理之間差異極顯著，CK2和T2差異顯著;接種第14天，T1和CK1差異極顯著，T2和CK2差異極顯著，T1和T2差異極顯著。

表4 不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的CAT活性比較

Table 4 Comparison of CAT activity between diseased leaves and healthy leaves of different cultivars

處理Treatment第7天Day7第14天Day14CK129.24cC36.21cCT150.59aA76.90bBCK232.96cBC44.20cCT239.89bB144.10aA

2

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2

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4

PPO活性變化

不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的PPO活性比較見表5?？芍航臃N病原菌14天后，處理T1的PPO活性增加幅度大于處理T2，處理T1增加了20.05%，處理T2增加了9.55%。在接種第7天，T2與CK1、CK2和T1之間差異極顯著，CK1和T1之間差異顯著；在接種第14天，CK1和T1之間差異顯著，CK2和T2差異極顯著，T1和T2無明顯差異。

表5 不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的PPO活性比較

Table 5 Comparison of PPO activity between diseased leaves and healthy leaves of different cultivars

處理Treatment第7天Day7第14天Day14CK12.45cB2.88bcABT12.71bB3.39abACK22.73bB2.48cCT23.22aA3.56aA

2

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2

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5

POD活性變化

不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的POD活性比較見表6?？芍航臃N病原菌14天后，2 個木薯品種葉片的POD活性都明顯的增加，‘新選048’葉片的POD活性增加幅度更大，比接種第7天增加了94.78%，T1的POD活性增加了91.63%。接種第7天，CK1和T1差異極顯著，CK2和T2差異極顯著，T1和T2無顯著差異；接種第14天，發(fā)病的木薯葉片POD活性迅速升高，CK1和T1差異極顯著，CK2和T2差異極顯著，T1和T2差異極顯著。

表6 不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的POD活性比較

Table 6 Comparison of POD activity between diseased leaves and healthy leaves of different cultivars

處理Treatment第7天Day7第14天Day14CK134.23bB40.44cCT146.70aA558.25bBCK231.23bB43.13cCT253.33aA1010.62aA

2.3 木薯葉片細(xì)菌性枯萎病病情指數(shù)與各防御酶活性的相關(guān)性分析結(jié)果

病情指數(shù)與‘GR891’和‘新選048’植株5種酶活性相關(guān)性分析結(jié)果見表7。可知：病情指數(shù)與GR891植株的SOD酶活性中度負(fù)相關(guān)，與CAT酶活性關(guān)系極弱，與PPO酶活性高度負(fù)相關(guān)，與POD酶活性高度正相關(guān)，與PAL顯著性負(fù)相關(guān)；病情指數(shù)與‘新選048’植株的SOD酶活性低度正相關(guān)，與PAL、CAT酶活性不相關(guān)，與PPO、POD酶活性顯著性負(fù)相關(guān)。本次研究得出，‘新選048’防御性酶活性與病害關(guān)聯(lián)性較小，而‘GR891’防御性酶活與病害有明顯的相關(guān)性，也說明侵染細(xì)菌性枯萎病病原菌后能夠引起不同木薯品種酶活性變化，且‘新選048’的抗性比‘GR891’強。

表7 病情指數(shù)與酶活性相關(guān)分析

Table 7 Correlation between disease index and enzyme activity

木薯品種VarietySODPALCATPPOPODGR891-0.513-0.983-0.379-0.8710.873新選048XX0480.407-0.3540.335-0.907-0.936

3 討 論

木薯葉片受到細(xì)菌性枯萎病病原菌侵染后，生長受到抑制。本研究發(fā)現(xiàn)木薯葉片受到病原菌噴霧法侵染后，葉片由原來綠色然后退綠最后枯黃、萎蔫，發(fā)病后‘新選048’葉片的病斑面積比‘GR891’小，病斑長度也比‘GR891’的小，說明‘新選048’的抗病性比‘GR891’強。

宋瑞芳等在研究發(fā)現(xiàn)煙草抗病品種PAL活性高于感病品種；史芳芳等研究不同抗病品種的荷花接種腐爛病菌后發(fā)現(xiàn)POD、PPO活性與品種抗病性呈正相關(guān)關(guān)系，可能是因為抗病品種受病原菌侵染后生成的木質(zhì)素比感病品種多，酶活性升高快。本研究發(fā)現(xiàn)接種Cax-03菌液后2 個品種的PAL活性出現(xiàn)了不一樣的變化趨勢。接種7 d時，‘GR891’的PAL活性高于對照；接種發(fā)病后，‘新選048’與抗性呈正相關(guān)，而‘GR891’與抗性負(fù)相關(guān)，說明受到侵害后，‘新選048’品種PAL活性升高合成木質(zhì)素，阻止病原菌破壞細(xì)胞壁，而病原菌侵入后‘GR891’品種PAL活性降低，木質(zhì)素合成減少，病原菌入侵增多。2 個品種接種病原菌后PAL出現(xiàn)不一致的變化規(guī)律，其與抗枯萎病的關(guān)系還需要進步研究。接種后‘新選048’的POD活性顯著增高，呈極顯著差異，說明‘新選048’抗性較強。PPO活性在接種發(fā)病后均呈升高趨勢，GR891的PPO活性增長幅度大于新選048的PPO活性，但‘新選048’活性高于‘GR891’，說明PPO和抗病反應(yīng)有一定關(guān)系。接種14 d后，2 個木薯品種的SOD活性變化無明顯差異，說明SOD活性與植物抗病性之間的關(guān)聯(lián)不大，這與吳超等研究香蕉枯萎病與防御酶活性之間的關(guān)系中得出的結(jié)論一致。劉學(xué)輝等對辣椒感染番茄斑萎病毒后，3 個辣椒品種CAT活性均增高，并且峰值出現(xiàn)在第14天；宋培玲等對油菜黑脛病菌防御酶活性和劉延碩等對人參銹腐病的研究表明CAT活性與其抗病性呈正相關(guān)性，與本試驗研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)接種Cax-03菌液后，木薯品種‘GR891’發(fā)病更嚴(yán)重，病斑密度更大，病斑長度更長，病情指數(shù)高，病害侵染程度比‘新選048’重；‘新選048’品種葉片中CAT、PPO和POD活性均高于‘GR891’品種。因此，‘新選048’品種比‘GR891’品種抗病性更強。本研究可為早期鑒別細(xì)菌性枯萎病并篩選抗病木薯品種提供依據(jù)。