癌-睪丸抗原NY-SAR-35在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況及其臨床意義

王燕靖，沈 寧，羅 彬，趙英倫，陸紹龍，葉小龍，張 沅，張煜萱，謝小薰，張慶梅

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤，位居腫瘤死亡的第四位。CRC患者早期癥狀隱匿，大部分患者首診時(shí)已屬晚期。雖然近年手術(shù)切除輔以放化療等傳統(tǒng)治療方式取得了較大進(jìn)展，但晚期CRC患者的預(yù)后情況并未得到顯著改善。新的輔助治療策略仍是現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)，免疫治療則是其中一種具有臨床應(yīng)用前景的新型治療方法，但開(kāi)展腫瘤免疫治療需要鑒定腫瘤特異性抗原。癌-睪丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)在多種腫瘤中高表達(dá)，而在除睪丸和胎盤(pán)之外的正常組織限制性表達(dá)，被認(rèn)為是腫瘤免疫治療的理想靶抗原。NY-SAR-35是CTA家族中的一員。有文獻(xiàn)報(bào)道NY-SAR-35 mRNA在CRC組織不表達(dá)，但該研究?jī)H檢測(cè)了9例CRC組織，且缺少癌旁組織及臨床意義分析，其結(jié)果難以客觀地反映NY-SAR-35在CRC的表達(dá)情況。鑒此，本研究擴(kuò)大CRC樣本例數(shù)，并收集匹配的癌旁組織及患者臨床資料，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)NY-SAR-35 mRNA的表達(dá)，并分析其臨床意義，以初步評(píng)估其在預(yù)測(cè)CRC患者預(yù)后和作為免疫治療靶抗原的應(yīng)用前景。

1 對(duì)象與方法

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研究對(duì)象 選擇2009年10月至2012年5月于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科接受手術(shù)治療的CRC患者59例。其中男42例，女17例；年齡30～86(55.55±14.36)歲；根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer,AJCC)的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期21例。均經(jīng)手術(shù)取癌組織及配對(duì)的癌旁組織。研究獲廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：審20210157號(hào))，標(biāo)本獲取前均經(jīng)患者及其家屬同意。

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納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為CRC；(2)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)入院前已接受其他抗腫瘤方案治療；(2)合并其他嚴(yán)重自身免疫性疾?。?3)伴發(fā)其他惡性腫瘤。

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資料收集 通過(guò)醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集患者的臨床資料，包括性別、年齡等一般人口學(xué)信息，以及腫瘤大小、臨床分期、組織學(xué)類型、轉(zhuǎn)移情況等疾病情況信息。

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標(biāo)本采集 腹腔鏡手術(shù)中切取CRC患者腫瘤組織和癌旁組織(距離腫瘤邊緣>1.5 cm)各59例，其中結(jié)腸部位25例，直腸部位34例。CRC組織標(biāo)本均經(jīng)2名以上有經(jīng)驗(yàn)的主任病理醫(yī)師檢查確診。組織離體后15 min內(nèi)，置液氮速凍，后轉(zhuǎn)置-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)錂z。

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NY-SAR-35 mRNA檢測(cè)方法

1.5.1 總RNA提取 取約300 mg組織標(biāo)本，迅速加入裂解液后進(jìn)行勻漿，應(yīng)用RNA抽提試劑盒(諾唯贊生物科技股份有限公司)提取組織總RNA，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所得總RNA溶于無(wú)RNA酶的純水中，用微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)無(wú)降解。

1.5.2 cDNA合成 取1 μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，諾唯贊生物科技股份有限公司)說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。經(jīng)PCR擴(kuò)增管家基因P53檢測(cè)cDNA的質(zhì)量，將合格的cDNA用于目的基因擴(kuò)增。P53引物序列：5′-CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG-3′(上游)，5′-CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG-3′(下游)，由上海吉瑪公司合成。

1.5.3 目的基因擴(kuò)增 應(yīng)用2×Rapid Taq Master Mix試劑盒(諾唯贊生物科技股份有限公司)進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系：PCR Master Mix(2×Premix)12.5 μl，ddHO 9.5 μl，上、下游引物各1.0 μl，cDNA 1 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃充分延伸10 min。NY-SAR-35引物序列：5′-CTTGGTGCGATCAGCCTTAT-3′(上游)，5′-TTGATGCATGAAAACAGAACTC-3′(下游)。以睪丸cDNA作為陽(yáng)性對(duì)照，以DEPC處理水代替cDNA模板作為陰性對(duì)照。RT-PCR反應(yīng)完畢取產(chǎn)物10 μl行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。以P53為內(nèi)參，保證各標(biāo)本內(nèi)參條帶亮度一致的前提下，目的基因擴(kuò)增條帶清晰可見(jiàn)即為陽(yáng)性表達(dá)。將已純化PCR產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

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隨訪 通過(guò)醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)記錄和電話隨訪方式收集患者隨訪資料。在術(shù)后2年內(nèi)，每3個(gè)月隨訪1次；術(shù)后3～4年每6個(gè)月隨訪1次；手術(shù)5年后每年隨訪1次。本次研究隨訪時(shí)間截至2020年5月，以發(fā)生死亡為結(jié)局。

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統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用成組

t

檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分率)[

n

(%)]表示，CRC組與癌旁組織組間比較采用McNemar′s檢驗(yàn)，NY-SAR-35陽(yáng)性表達(dá)組與陰性表達(dá)組間比較采用

χ

檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，以log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較。采用Cox回歸分析影響CRC患者生存預(yù)后的因素。

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

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NY-SAR-35 mRNA電泳和測(cè)序結(jié)果 經(jīng)電泳后，在300～400 bp之間出現(xiàn)一條清晰的條帶，與NY-SAR-35 mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物大小(376 bp)一致。見(jiàn)圖1。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)基因庫(kù)檢索序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，證實(shí)所擴(kuò)增的產(chǎn)物為NY-SAR-35目的片段。見(jiàn)圖2。

M：DNA marker；T1～T7：CRC組織；N1～N7：癌旁組織；P：陽(yáng)性對(duì)照；Ne：陰性對(duì)照

圖1 NY-SAR-35 mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖

圖2 擴(kuò)增產(chǎn)物BLAST比對(duì)結(jié)果圖

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CRC組織和癌旁組織NY-SAR-35 mRNA表達(dá)情況比較 CRC組織中NY-SAR-35 mRNA陽(yáng)性表達(dá)21例(35.59%)，癌旁組織陽(yáng)性表達(dá)8例(13.56%)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 CRC組織和癌旁組織NY-SAR-35 mRNA表達(dá)情況比較()

CRC組織癌旁組織陽(yáng)性陰性總數(shù)陽(yáng)性12021陰性73138總數(shù)85159

注：經(jīng)McNemar′s檢驗(yàn)，=0.019

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NY-SAR-35 mRNA陽(yáng)性組與陰性組臨床特征比較 NY-SAR-35 mRNA陽(yáng)性組腫瘤直徑≥5 cm的人數(shù)比例大于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。兩組在性別、年齡、腫瘤位置、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)水平、T分期、N分期、M分期、TNM分期、組織學(xué)類型和分化程度方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 NY-SAR-35 mRNA陽(yáng)性組與陰性組臨床特征比較[(%)]

組 別例數(shù)性別年齡(歲)腫瘤直徑(cm)腫瘤位置CEA(ng/ml)T分期男女<56≥56<5≥5結(jié)腸直腸≤5>5T1～2T3～4陽(yáng)性組2116(76.19)5(23.81)12(57.14)9(42.86)6(28.57)15(71.43)12(57.14)9(42.86)8(38.10)13(61.90)3(14.29)18(85.71)陰性組3826(68.42)12(31.58)20(52.63)18(47.37)24(63.16)14(36.84)13(34.21)25(65.79)22(57.89)16(42.11)11(28.95)27(71.05)χ2-0.3980.1116.4742.9132.1221.606P-0.5280.7390.0110.0880.1450.205組 別例數(shù)N分期M分期TNM分期組織學(xué)類型分化程度N0N1～3M0M1Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ管狀及乳頭狀腺癌黏液腺癌及印戒細(xì)胞癌高分化中分化低分化陽(yáng)性組2117(80.95)4(19.05)18(85.71)3(14.29)15(71.43)6(28.57)21(100.00)0(0.00) 7(33.33)10(47.62)4(19.05)陰性組3826(68.42)12(31.58)35(92.11)3(7.89) 23(60.53)15(39.47)32(84.21) 6(15.79)9(23.68)18(47.37)11(28.95)χ2-1.0750.6050.7013.6910.986P-0.3000.4370.4020.0550.611

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NY-SAR-35 mRNA表達(dá)情況與CRC患者生存預(yù)后的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 研究對(duì)象獲得隨訪1～98個(gè)月，隨訪過(guò)程中無(wú)失訪患者，中位隨訪時(shí)間為54個(gè)月。截至隨訪終點(diǎn)，死亡36例，生存23例。CRC患者中NY-SAR-35 mRNA陰性組的生存預(yù)后優(yōu)于陽(yáng)性組(生存期：57.24個(gè)月 vs 40.71個(gè)月；log-rank檢驗(yàn)：

χ

=4.356，

P

=0.037)。見(jiàn)圖3?。進(jìn)一步分層分析結(jié)果顯示，無(wú)論對(duì)于TNM分期分為Ⅰ～Ⅱ期或Ⅲ～Ⅳ期的CRC患者，NY-SAR-35 mRNA陰性組的生存預(yù)后均優(yōu)于陽(yáng)性組(Ⅰ～Ⅱ期CRC患者生存期：77.32個(gè)月 vs 53.80個(gè)月；log-rank檢驗(yàn)：

χ

=8.830，

P

=0.003。Ⅲ～Ⅳ期CRC患者生存期：28.60個(gè)月 vs 8.00個(gè)月；log-rank檢驗(yàn)：

χ

=8.013，

P

=0.005)。見(jiàn)圖3??。

?NY-SAR-35 mRNA陰性組 vs 陽(yáng)性組；?Ⅰ～Ⅱ期分層下NY-SAR-35 mRNA陰性組 vs 陽(yáng)性組；?Ⅲ～Ⅳ期分層下NY-SAR-35 mRNA陰性組 vs 陽(yáng)性組

圖3 CRC患者的生存曲線圖

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影響CRC患者生存預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析結(jié)果以至隨訪結(jié)束之日發(fā)生死亡為結(jié)局進(jìn)行Cox回歸分析，結(jié)果顯示，T分期為T(mén)期、N分期為N期、M分期為M期以及NY-SAR-35 mRNA陽(yáng)性表達(dá)是影響CRC患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(

P

<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 影響CRC患者生存預(yù)后的Cox回歸分析結(jié)果

變 量HR(95%CI)PaHR(95%CI)aP性別(男)1.046(0.504～2.171)0.903--年齡(≥56歲)1.041(0.541～2.005)0.902--腫瘤位置(直腸)1.402(0.717～2.743)0.316--腫瘤大小(≥5 cm)1.442(0.743～2.801)0.272--CEA(>5 ng/ ml)1.863(0.964～3.603)0.058--T分期(T3～4)3.312(1.167～9.399)0.01615.664(3.579～68.550)0.000N分期(N1～3)4.059(2.016～8.170)0.00040.102(11.075～145.203)0.000M分期(M1)9.785(7.238～122.563)0.000187.338(31.321～1121.000)0.000TNM分期(Ⅲ～Ⅳ)7.009(3.501～14.032)0.0002.492(0.125～49.579)0.710組織學(xué)類型(黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌)1.252(0.443～3.543)0.668--分化程度(中分化)1.102(0.374～3.252)0.860分化程度(低分化)1.066(0.280～4.061)0.925--NY-SAR-35 mR-NA表達(dá)(陽(yáng)性)1.972(1.023～3.803)0.0302.813(1.300～6.086)0.009

3 討論

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近年來(lái)，腫瘤免疫治療已成為繼手術(shù)、放療和化療之后的第4種腫瘤治療方式，其優(yōu)勢(shì)在于可特異性靶向腫瘤，對(duì)正常細(xì)胞傷害小。開(kāi)展腫瘤免疫治療的先決條件是鑒定腫瘤特異性抗原。CTA是一類在除睪丸和胎盤(pán)之外的正常組織中不表達(dá)，而在多種腫瘤中廣泛表達(dá)，且可引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的腫瘤抗原。因其獨(dú)特的表達(dá)模式，CTA被認(rèn)為是理想的腫瘤標(biāo)志物和免疫治療靶點(diǎn)。目前已有一些CTA(如MAGE-A3、NY-ES0-1等)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，在一些腫瘤的治療中初步顯示出不錯(cuò)的療效。然而，現(xiàn)有研究顯示，多數(shù)CTA在CRC中的表達(dá)率并不高，這極大地限制了CTA在CRC免疫治療中的應(yīng)用。

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NY-SAR-35是2003年由Lee等通過(guò)血清學(xué)表達(dá)克隆分析(serological analysis of recombinant cDNA expression library,SEREX)在纖維肉瘤及惡性纖維組織細(xì)胞瘤患者中鑒定出的一種CTA基因，根據(jù)其在CTA數(shù)據(jù)庫(kù)的編號(hào)又稱為CT37。與CTA家族的許多成員一樣，NY-SAR-35基因定位于X染色體。有研究報(bào)道，NY-SAR-35 mRNA在除睪丸之外的多種正常組織幾乎不表達(dá)，但在多種腫瘤中表達(dá)并具有不同的表達(dá)率：肺癌為33%，黑色素瘤為6.3%，卵巢癌為8.3%，乳腺癌為23.1%，膀胱癌為41.7%。研究發(fā)現(xiàn)NY-SAR-35 mRNA在腫瘤的表達(dá)可能與其基因啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化有關(guān)。另外，實(shí)驗(yàn)研究還顯示，NY-SAR-35還可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。提示NY-SAR-35可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，具有成為腫瘤標(biāo)志物和免疫治療靶點(diǎn)的潛力。

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本研究結(jié)果顯示，CRC組織NY-SAR-35 mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率為35.59%，顯著高于癌旁組織(13.56%)，這與Lee等的研究結(jié)果差異較大，考慮與研究納入樣本的例數(shù)差異及腫瘤的異質(zhì)性表達(dá)有關(guān)。本研究中有2例NY-SAR-35 mRNA 陽(yáng)性表達(dá)的CRC組織，其癌旁組織也陽(yáng)性表達(dá)NY-SAR-35 mRNA，這可能與癌旁組織的癌前病變或腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)癌旁組織有關(guān)。癌旁組織并非真正意義上的正常組織，曾有研究者檢測(cè)距離CRC組織20 mm、21～50 mm和50 mm以上的范圍內(nèi)收集的癌旁組織，發(fā)現(xiàn)離CRC組織距離越遠(yuǎn)的癌旁組織，其癌相關(guān)基因MAGE mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率越低。由此可見(jiàn)，在收集癌旁組織時(shí)需特別注意距離癌組織的位置和范圍。此外，本研究有7例NY-SAR-35 mRNA陰性表達(dá)的CRC組織，其癌旁組織卻為NY-SAR-35 mRNA陽(yáng)性表達(dá)，這可能與CTA的異質(zhì)性表達(dá)或腫瘤抗原調(diào)變有關(guān)。

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本研究結(jié)果顯示，NY-SAR-35 mRNA表達(dá)與腫瘤直徑具有顯著關(guān)聯(lián)性，與體積小的腫瘤組織相比，體積大的腫瘤組織NY-SAR-35 mRNA陽(yáng)性表達(dá)率更高。腫瘤大小在一定程度上可反映腫瘤細(xì)胞的增殖程度，這提示NY-SAR-35可能與腫瘤的惡性生長(zhǎng)有關(guān)。另外，生存分析結(jié)果顯示，CRC患者中NY-SAR-35 mRNA陰性組的生存預(yù)后優(yōu)于陽(yáng)性組，且Cox回歸分析結(jié)果顯示，NY-SAR-35 mRNA陽(yáng)性表達(dá)是影響CRC患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這些結(jié)果再次證明NY-SAR-35在CRC的致病機(jī)制中可能發(fā)揮的重要作用，且具有作為預(yù)測(cè)CRC患者預(yù)后標(biāo)志物的潛在價(jià)值。

綜上所述，NY-SAR-35 mRNA在CRC組織中高表達(dá)，其與腫瘤大小及患者的生存預(yù)后具有關(guān)聯(lián)性，具有作為免疫治療潛在靶點(diǎn)的價(jià)值，但其在CRC發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。