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      兒童急性淋巴細(xì)胞白血病化療前后腸道菌群變化特點(diǎn)

      2022-11-15 02:26:35陳森敏劉四喜陳芬王春艷麥惠容袁秀麗文飛球
      中國當(dāng)代兒科雜志 2022年5期
      關(guān)鍵詞:菌群糞便腸道

      陳森敏 劉四喜 陳芬 王春艷 麥惠容 袁秀麗 文飛球

      (深圳市兒童醫(yī)院血液腫瘤科,廣東深圳 518038)

      人體微生物群落主要分布于黏膜器官,包括腸道、口腔和陰道。腸道菌群在人體許多生理過程中發(fā)揮重要作用,包括協(xié)助宿主免疫功能的成熟及發(fā)育、抵抗病原微生物的過度生長、影響宿主細(xì)胞的增殖和新生血管形成等。因此,腸道菌群被認(rèn)為是早期生命發(fā)育和終生健康的關(guān)鍵因素。腸道菌群在多種疾病中可能起推動或阻礙的作用[1]。研究發(fā)現(xiàn),影響免疫細(xì)胞的疾病,如急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia,ALL)、炎癥性腸病和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎與腸道微生物組成的變化(生態(tài)失調(diào))有關(guān)[2-4]。但腸道菌群在ALL發(fā)病時及化療前后的變化研究尚不充分,且存在不一致的研究結(jié)果[5-7]。因此,本研究采集ALL患兒糞便標(biāo)本檢測腸道菌群的微生物組成,探討化療對ALL患兒腸道菌群的影響,以期能在ALL及其化療相關(guān)并發(fā)癥的診治中發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)。

      1 資料與方法

      1.1 研究對象與分組

      前瞻性選取2018 年1~9 月在深圳市兒童醫(yī)院確診的ALL 患兒40 例納入ALL 組;另選取ALL 患兒的健康同胞10 例納入健康對照組。兩組研究對象的體重指數(shù)均在正常范圍內(nèi),年齡1~10 歲,在取樣前2個月內(nèi)均未使用益生菌,且在取樣前1個月內(nèi)均無腹瀉。ALL 組患兒納入標(biāo)準(zhǔn):初次診斷ALL;入組前未化療。排除標(biāo)準(zhǔn):復(fù)發(fā)的ALL;合并有營養(yǎng)不良或肥胖等其他疾病的患兒。健康對照組兒童均無胃腸道疾病,采集樣本前1個月內(nèi)無抗生素接觸史。

      收集ALL組患兒化療前、化療后2周、化療后1 個月及化療后2 個月4 個時間點(diǎn)的糞便;同期采集ALL患兒的健康同胞糞便1次。

      本研究已獲得深圳市兒童醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn),并獲得所有參與實(shí)驗(yàn)研究的兒童監(jiān)護(hù)人的知情同意。

      1.2 ALL的診斷、化療方案及危險度分級

      ALL的診斷基于形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[8]。根據(jù)廣東地區(qū)ALL-GD-2008方案(以BFM2002為基礎(chǔ))[9]按序化療。以初診時年齡、白細(xì)胞總數(shù)、免疫分型、口服潑尼松第8天外周血幼稚細(xì)胞數(shù)及治療第15天、第33天骨髓象作為早期化療敏感性評估指標(biāo),分為標(biāo)危、中危、高危3組。標(biāo)危及中危組化療階段分為VDLD誘導(dǎo)緩解、CAM 鞏固治療、MTX 鞏固治療、VALD 再誘導(dǎo)緩解及CAM鞏固治療。高危組將MTX鞏固治療換為Block1、Block2及Block3強(qiáng)化治療?;煹?5 天開始所有患者均予復(fù)方磺胺甲噁唑口服預(yù)防卡氏肺孢子蟲病。各階段化療藥物及時間見表1。

      表1 化療方案、藥物及時間

      表1 (續(xù))

      1.3 糞便DNA提取

      采集ALL 患兒及健康對照組兒童的新鮮糞便至少2 g,放入滅菌的一次性大便常規(guī)管內(nèi),置于冰盒中轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室分裝后轉(zhuǎn)移入-80℃冰箱保存。用糞便DNA 提取試劑盒(Omega Bio-Tek,美國)從糞便樣本中分離提取DNA。

      1.4 16S rDNA基因的擴(kuò)增及測序

      采用熒光定量PCR 擴(kuò)增16S rDNA 基因的V3~V4 區(qū),選擇特異性引物(前端引物為:338F-5'-CTACGGGAGGCAGCAG-3';后端引物為:806R-5'-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。 反 應(yīng) 體 系(25 μL): Pusion Hot Start Flex 2×Master Mix(NEB,美國)12.5 μL、Forward Primer(1 μmol/L)2.5 μL、 Reverse Primer (1 μmol/L) 2.5 μL、Template DNA 50 ng,加入ddH2O 至總體積為25 μL。反 應(yīng) 條 件:98℃30 s;98℃10 s,54℃30 s,72℃45 s,35 個循環(huán);72℃10 min。隨后將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,并對目標(biāo)片段進(jìn)行回收,回收后使用AMPure XP beads 回收試劑盒(Beckman,美國)進(jìn)行純化。使用MiSeq 測序儀(Illumina,美國) 進(jìn)行2×300 bp 的雙端測序,相應(yīng)試劑為MiSeq Reagent Kit V3(Illumina,美國),獲得各模板DNA 片段的測序序列,即讀數(shù)。

      1.5 生物信息分析

      去除原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量的Reads,通過97%相似度的標(biāo)準(zhǔn)聚類,得到操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)。然后使用Mothur 軟件,構(gòu)建稀釋性曲線。分別從每個聚類單元挑選1條代表性序列,以Greengene13.8的數(shù)據(jù)庫為模板注釋物種名稱組成OTUs。歸類后根據(jù)每個OTU 中序列的條數(shù)計算OTU豐度表,根據(jù)該物種豐度表進(jìn)行α多樣性分析、β多樣性分析及物種分類與豐度分析。根據(jù)分類學(xué)組成對樣本按照不同的分組條件用LEfSe軟件進(jìn)行線型判別分析,找出有顯著性差異的類群。

      1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

      采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn);ALL患兒化療前后比較采用配對樣本t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(P25,P75)]表示,兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗(yàn),ALL患兒化療前后比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 一般資料

      40 例ALL 患兒,男25 例,女15 例,男∶女1.7∶1;T系4例(10%),B系36例(90%);標(biāo)危8 例(20%),中危21 例(52%),高 危11 例(28%);初診時平均年齡(5.2±2.4)歲。對照組中,男6例,女4例,平均年齡(5.8±2.1)歲。兩組之間男女比例及年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

      2.2 糞便樣本菌群測序結(jié)果分析

      本研究總共收集了122個糞便樣本,總共獲得3907880個讀數(shù),平均每個樣品為32032個讀數(shù),最小值和最大值分別為13531和57106,中位讀數(shù)為33092。化療后2 周組30 個樣品共1048652 個讀數(shù),化療后1 個月組35 個樣品共1046014 個讀數(shù),化療后2 個月組15 個樣品共405956 個讀數(shù),化療前組32 個樣品共1134937 個讀數(shù),健康對照組10個樣品中共272321個讀數(shù)。

      2.3 ALL 患兒不同時期腸道菌群的豐度及多樣性分析

      基于高通量測序數(shù)據(jù),對每組樣本的菌群豐度和多樣性進(jìn)行進(jìn)一步檢測。其中,豐度由OTU數(shù)目和Chao1值體現(xiàn),多樣性由PD值、Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)體現(xiàn),覆蓋率指數(shù)由Good's coverage值體現(xiàn)。

      各樣本Good's coverage 值均在0.98 以上,覆蓋率較好,測序結(jié)果可代表各樣本腸道菌群實(shí)際組成。與健康對照組相比,ALL 組化療前腸道菌群OTUs、Chao1及PD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但Shannon 指數(shù)及Simpson 指數(shù)明顯降低(P<0.05);ALL 組化療后1 個月及2 個月的腸道菌群OTUs、Chao1及PD值顯著下降(P<0.05),在化療后2 周、1 個月、2 個月Shannon 指數(shù)及Simpson指數(shù)仍明顯低于健康對照組(P<0.05)。見表2~5。

      表2 化療前ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對照組比較 (±s)

      表2 化療前ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對照組比較 (±s)

      組別健康對照組化療前ALL組t值P值n 1032 OTUs 754±418723±5040.1770.860 Good's coverage 0.986±0.0040.990±0.005-1.9850.054 Chao11183±5671122±7020.2460.806 PD 46±1744±220.1880.852 Shannon 5.0±1.04.0±1.82.2660.032 Simpson 0.90±0.070.75±0.243.1300.003

      表3 化療后2周ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對照組比較 (±s)

      表3 化療后2周ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對照組比較 (±s)

      組別健康對照組化療后2周ALL組t值P值n 1030 OTUs 754±418586±3431.2740.210 Good's coverage 0.986±0.0040.991±0.004-3.2960.002 Chao11183±567918±5311.3420.187 PD 46±1737±171.3990.169 Shannon 5.0±1.03.8±1.52.3350.025 Simpson 0.90±0.070.77±0.212.8360.007

      表4 化療后1個月ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對照組比較 (±s)

      表4 化療后1個月ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對照組比較 (±s)

      組別健康對照組化療后1個月ALL組t值P值n 1035 OTUs 754±418407±1983.7220.001 Good's coverage 0.986±0.0040.993±0.003-6.080<0.001 Chao11183±567625±2974.201<0.001 PD 46±1730±103.691<0.001 Shannon 5.0±1.03.5±1.23.5420.001 Simpson 0.90±0.070.77±0.182.1670.036

      表5 化療后2個月ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對照組比較 (±s)

      表5 化療后2個月ALL患兒腸道菌群豐度和多樣性與健康對照組比較 (±s)

      組別健康對照組化療后2個月ALL組t值P值n 1015 OTUs 754±418401±3192.3940.025 Good's coverage 0.986±0.0040.993±0.005-3.7820.001 Chao11183±567627±4822.6300.015 PD 46±1729±152.6090.016 Shannon 5.0±1.03.4±1.43.0900.005 Simpson 0.90±0.070.75±0.182.8240.010

      和化療前相比,ALL 組化療后1 個月及2 個月的腸道菌群Chao1 及PD 值顯著下降(P<0.05),盡管化療后2 個月OTUs 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.066),但仍有下降趨勢;總體趨勢來看,ALL患兒腸道菌群物種豐度在化療后2個月最低,其次是化療后1個月和2周。見表6~8。

      表6 ALL患兒化療前與化療后2周腸道菌群豐度和多樣性比較 (±s)

      表6 ALL患兒化療前與化療后2周腸道菌群豐度和多樣性比較 (±s)

      組別化療前化療后2周t值P值n 2525 OTUs 677±508622±3430.5370.597 Good's coverage 0.989±0.0060.991±0.005-1.4520.159 Chao11166±749959±5081.3570.187 PD 45±2339±161.1990.242 Shannon 4.0±1.83.9±1.40.2670.792 Simpson 0.76±0.220.78±0.21-0.3790.708

      表7 ALL患兒化療前與化療后1個月腸道菌群豐度和多樣性比較 (±s)

      表7 ALL患兒化療前與化療后1個月腸道菌群豐度和多樣性比較 (±s)

      組別化療前化療后1個月t值P值n 2929 OTUs 668±485386±1863.1500.004 Good's coverage 0.990±0.0060.993±0.003-3.1290.004 Chao11122±715632±3053.942<0.001 PD 44±2230±103.6800.001 Shannon 4.0±1.83.5±1.31.3550.186 Simpson 0.74±0.250.76±0.20-0.3480.731

      表8 ALL患兒化療前與化療后2個月腸道菌群豐度和多樣性比較 (±s)

      表8 ALL患兒化療前與化療后2個月腸道菌群豐度和多樣性比較 (±s)

      組別化療前化療后2個月t值P值n 1212 OTUs 609±467374±246-2.0340.066 Good's coverage 0.991±0.0050.993±0.004-1.5330.154 Chao1976±689578±3492.2060.050 PD 40±2228±132.2800.044 Shannon 3.4±1.73.4±1.3-0.0950.926 Simpson 0.66±0.260.75±0.19-1.1410.278

      基于weighted unifrac距離算法對所有樣品進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA分析)。盡管化療前及化療后2周、1個月、2個月ALL 組與健康對照組的樣本差異有統(tǒng)計學(xué)意義(R=0.035,P=0.041),但各組的腸道菌群結(jié)構(gòu)總體分離不明顯。如圖1所示。

      2.4 ALL患兒腸道菌群組成分析及比較

      在門水平上,處于前5位的腸道菌群分別為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、疣微菌門(圖2)。分析ALL 組與健康對照組及ALL 患兒化療前后腸道菌群相對豐度的統(tǒng)計學(xué)差異。與健康對照組相比,ALL患兒化療前變形菌門的相對豐度有升高趨勢,并在化療后1個月及2個月顯著升高(P<0.05);ALL 患兒化療前放線菌門的相對豐度有降低趨勢,并在化療后2 周、1 個月及2 個月顯著降低(P<0.05);ALL 患兒僅在化療后1 個月擬桿菌門的相對豐度明顯降低(P=0.009)(表9~12)。與化療前相比,ALL 患兒化療后放線菌門的相對豐度有降低趨勢,變形菌門的相對豐度有升高趨勢,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);疣微菌門的相對豐度在化療后1 個月顯著降低(P=0.001)(表13~15)。

      表9 化療前ALL患兒腸道菌群前5門相對豐度與健康對照組比較 [M(P25,P75)]

      表10 化療后2周ALL患兒腸道菌群前5門相對豐度與健康對照組比較 [M(P25,P75)]

      表11 化療后1個月ALL患兒腸道菌群前5門相對豐度與健康對照組比較 [M(P25,P75)]

      表12 化療后2個月ALL患兒腸道菌群前5門相對豐度與健康對照組比較 [M(P25,P75)]

      表13 ALL患兒化療前與化療后2周腸道菌群前5門相對豐度比較 [M(P25,P75)]

      表14 ALL患兒化療前與化療后1個月腸道菌群前5門相對豐度比較 [M(P25,P75)]

      表15 ALL患兒化療前與化療后2個月腸道菌群前5門相對豐度比較 [M(P25,P75)]

      在屬水平上,處于前7位的腸道菌群分別為雙歧桿菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、埃希氏菌-志賀氏菌屬、活潑瘤胃球菌屬、克雷伯菌屬和Faecalibacterium(圖3)。分析ALL組與健康對照組及ALL 患兒化療前后腸道菌群相對豐度的統(tǒng)計學(xué)差異。與健康對照組和ALL患兒化療前相比,ALL患兒化療后2 周、1 個月和2 個月腸球菌屬、鏈球菌屬和克雷伯菌屬的相對豐度有增加趨勢,雙歧桿菌屬、Faecalibacterium相對豐度有降低趨勢。雙歧桿菌屬相對豐度在ALL 患兒化療后2 周、1 個月及2 個月均較健康對照組顯著降低(P<0.05)??死撞鷮傧鄬ωS度在ALL患兒化療后1個月及2個月均較健康對照組顯著升高,并且在化療后1個月時較化療前顯著升高(P<0.05);盡管在化療后2個月與化療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.069),但仍有升高趨勢。 與健康對照組比較,F(xiàn)aecalibacterium相對豐度在ALL患兒化療前后均顯著降低,并且在化療后2周及1個月時相對豐度顯著低于化療前(P<0.05)。腸球菌屬相對豐度在ALL 患兒化療后1 個月及2 個月較健康對照組及化療前均明顯升高(P<0.05)。鏈球菌屬僅在化療后2周時較化療前明顯升高(P=0.021)。見表16~22。

      表16 化療前ALL患兒腸道菌群前7屬相對豐度與健康對照組比較 [M(P25,P75)]

      表17 化療后2周ALL患兒腸道菌群前7屬相對豐度與健康對照組比較 [M(P25,P75)]

      表18 化療后1個月ALL患兒腸道菌群前7屬相對豐度與健康對照組比較 [M(P25,P75)]

      表19 化療后2個月ALL患兒腸道菌群前7屬相對豐度與健康對照組比較 [M(P25,P75)]

      表20 ALL患兒化療前與化療后2周腸道菌群前7屬相對豐度比較 [M(P25,P75)]

      表21 ALL患兒化療前與化療后1個月腸道菌群前7屬相對豐度比較 [M(P25,P75)]

      表22 ALL患兒化療前與化療后2個月腸道菌群前7屬相對豐度比較 [M(P25,P75)]

      2.5 ALL 患兒化療前后不同時間點(diǎn)糞便中特異性差異腸道菌群

      LEfSe 分析發(fā)現(xiàn)在ALL 患兒化療不同時間點(diǎn)的部分腸道菌群在相對豐度上存在一定差異(圖4)。化療前、化療后2 周、1 個月和2 個月從門到種水平上的特異性腸道菌群分別有37、22、11 和20個?;熐跋鄬ωS度較高的腸道菌群分布在放線菌門、放線菌綱、雙歧桿菌屬等。化療后2周時相對豐度較高的腸道菌群分布在有乳桿菌目、極小韋永氏球菌種、瘤胃球菌屬等。化療后1個月時相對豐度較高的腸道菌群分布在s_Streptococcus_sanguinis_SK36、g_Fusicatenibacter 等?;熀? 個月時相對豐度較高的腸道菌群分布在丹毒絲菌目、丹毒絲菌科、葡萄球菌屬等。

      3 討論

      近年來的研究表明,腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能與菌群的多樣性和穩(wěn)定性失調(diào)有關(guān)。影響免疫細(xì)胞的疾病,如ALL、炎癥性腸病和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎與腸道微生物組成的變化有關(guān),其發(fā)生的原因是微生物多樣性的減少[2-4]。本研究發(fā)現(xiàn),和健康對照組比較,ALL 患兒化療前、化療后1 個月及2 個月腸道菌群alpha 多樣性均低于健康對照組,與先前的研究結(jié)果一致[6-7]。已發(fā)表的幾項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),ALL患兒的糞便菌群中富含擬桿菌門、腸球菌科和卟啉單胞菌科等細(xì)菌,而缺乏厚壁菌門、毛螺菌科和梭菌門等細(xì)菌[2]。本研究對ALL 患兒化療前糞便樣本的腸道菌群分析結(jié)果與上述報道不完全一致,可能與人種、地域、飲食結(jié)構(gòu)等因素不同有關(guān)。

      Zwielehner 等[10]發(fā)現(xiàn)化療后腸道菌群組成發(fā)生了改變。一項(xiàng)小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺后腸道細(xì)菌多樣性減少,并誘導(dǎo)了腸桿菌科、假單胞菌科(變形菌門)和腸球菌科(厚壁菌門)等潛在致病菌群優(yōu)勢生長[11]。有研究發(fā)現(xiàn)兒童ALL 患者在強(qiáng)化誘導(dǎo)和再誘導(dǎo)化療后腸道菌群多樣性顯著下降[12]。在本研究中,ALL 患兒糞便微生物在化療后物種豐富度降低,但化療前和化療后的alpha 多樣性差異無統(tǒng)計學(xué)意義,這與上述報道不一致,可能與樣本量小有關(guān)。但我們觀察到化療后不同時間點(diǎn)腸道菌群的微生物組成與化療前存在不同,與以往研究結(jié)果一致[2]。

      通過分析ALL 患兒化療后與化療前的腸道菌群相對豐度差異,我們發(fā)現(xiàn)變形菌門的相對豐度有升高趨勢,放線菌門的相對豐度有降低趨勢。屬水平上,雙歧桿菌和Faecalibacterium相對豐度在ALL 患兒化療后顯著降低,克雷伯菌相對豐度升高。Faecalibacterium prausnitzii可發(fā)酵膳食纖維,是有益的短鏈脂肪酸丁酸鹽的主要來源,并具有改善結(jié)腸炎的抗炎特性,因此是一種保護(hù)性細(xì)菌,對腸道健康不可或缺[13]。Faecalibacterium的相對豐度在兒童ALL 患者成年后仍降低,并與炎癥標(biāo)志物IL-6 和C 反應(yīng)蛋白呈負(fù)相關(guān)[10]。雙歧桿菌對人體健康的有益作用主要是防治腸道疾病和免疫紊亂[14]。而克雷伯菌為公認(rèn)的人類病原體。因此,本研究結(jié)果提示,化療部分降低了患者腸道有益菌的豐度,引起了ALL 患兒腸道有益菌和有害菌的失衡。

      對ALL 化療前后腸道菌群的結(jié)構(gòu)分析表明,來源于同一個病人的腸道菌群在化療前后各時間點(diǎn)的分布較分散(存在明顯的差異)。雖然化療前后各組樣本分布總體上分離不明顯,但腸道菌群結(jié)構(gòu)差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。屬水平上,ALL患兒化療前相對豐度較高的差異物種為雙歧桿菌,化療后2 周、1 個月和2 個月相對豐度較高的差異物種分別為瘤胃球菌、g_Fusicatenibacter 和葡萄球菌屬。

      本研究中ALL 患兒化療后樣本采集時間均在化療后2個月以內(nèi),對應(yīng)的化療階段是在VDLD誘導(dǎo)緩解與鞏固治療之間,均處于較強(qiáng)的化療期?;熀?周均在VDLD期間,化療后1個月均在第1個CAM 期間,多數(shù)患者的化療后2 個月在第2 個CAM方案后。本研究對象大部分在化療后2周進(jìn)入骨髓抑制期,故化療后1個月和2個月的時間點(diǎn)基本可以代表化療后骨髓抑制的狀態(tài),在化療后2個月時都有抗生素治療史。故本研究中ALL 患兒化療后腸道菌群的變化除與化療有關(guān)外,還可能受到宿主免疫狀態(tài)及抗生素的影響。

      本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),ALL患兒腸道菌群多樣性明顯低于健康兒童,化療后腸道菌群豐度顯著降低,部分有益菌豐度下降、病原菌豐度增加。但腸道菌群作為一個動態(tài)整體,受各種因素的影響,如年齡、壓力、飲食、健康狀態(tài)等[15]。對于ALL 患者的腸道菌群及其調(diào)節(jié)因素及對化療效果的影響,我們的認(rèn)識依然有限。本研究分析了10 例健康兒童樣本和40 例ALL 患兒在化療前后不同時間點(diǎn)的糞便樣本,未來尚需增加樣本并按疾病危險度、免疫分型等因素繼續(xù)分層對腸道菌群進(jìn)行分析研究并構(gòu)建動物模型驗(yàn)證。

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