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      基于高通量測序技術分析食物蛋白誘導性直腸結腸炎患兒腸道菌群特征

      2022-11-15 02:26:35陳順麗湯正珍黃波趙興艷陳壽珊
      中國當代兒科雜志 2022年5期
      關鍵詞:菌門雙歧菌群

      陳順麗 湯正珍 黃波 趙興艷 陳壽珊

      (1.遵義醫(yī)科大學研究生院,貴州遵義 563000;2.遵義醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院/遵義市第一人民醫(yī)院兒科,貴州遵義 563000)

      食物蛋白誘導性直腸結腸炎(food proteininduced proctocolitis,FPIP)是由免疫反應介導的一種或多種食物蛋白引起的遠端直腸結腸黏膜炎癥改變[1],在母乳喂養(yǎng)的嬰兒中很常見,約占60%[2],通常在出生后6個月內出現臨床癥狀,在1~4周齡時大便中出現間歇性血絲,患兒一般狀況好,無體重減輕,約22%的母乳喂養(yǎng)嬰兒存在濕疹[3],目前有關FPIP 發(fā)病機制尚不明確,認為主要與非免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)E介導有關[4]。治療措施主要為母親規(guī)避可疑過敏原或者患兒進食深度水解蛋白奶粉。研究發(fā)現FPIP 患兒口服乳酸桿菌能緩解癥狀[5],其機制尚不清楚。臨床中發(fā)現部分母親規(guī)避食物蛋白后患兒仍反復血便,對此尚無特效方法。

      近幾年,隨著過敏性疾?。ㄆ渲邪‵PIP)的發(fā)生率逐年增加,腸道菌群與過敏性疾病的關系是研究的熱點[6];食物過敏包括IgE 介導和非IgE 介導;研究顯示IgE 介導的過敏患兒的腸道菌群中雙歧桿菌、乳桿菌等專性厭氧菌明顯降低[7]。FPIP作為非IgE介導的過敏性疾病之一,是否存在腸道菌群失衡,目前尚未見報道。本研究擬通過高通量測序技術探究FPIP 患兒與健康嬰兒腸道菌群的差異性特征,進一步探討腸道菌群與FPIP 發(fā)病的相關性。

      1 資料與方法

      1.1 研究對象

      采用前瞻性病例對照研究設計,選取2018 年10 月至2021 年2 月我院兒科門診就診的FPIP 患兒31 例作為FPIP 組,診斷標準參照《食物過敏相關消化道疾病診斷與管理專家共識》[3];按照隨機數字表法另選取同期我院兒童保健科行健康體檢的嬰兒31 例作為健康對照組,近2 周無任何消化道癥狀。該研究已獲得遵義市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(2021-024)并取得入組嬰兒家屬知情同意。

      1.2 納入標準

      (1)兩組嬰兒(月齡<6 個月)均為純母乳喂養(yǎng),未添加任何輔食;(2)取樣前1周患兒母親飲食基本無變化;(3)入院前2周患兒及其母親均未使用過抗生素、類固醇激素、中草藥或益生菌制劑及飲品;(4)FPIP 組臨床表現主要以黏液血絲便為主要癥狀,一般情況可。

      1.3 排除標準

      (1)濕疹及特應性皮炎;(2)不潔飲食、細菌性痢疾、寄生蟲感染及其他系統感染導致癥狀性腹瀉,先天性巨結腸、腸套疊、胃腸道先天畸形或其他感染性疾?。唬?)合并基礎疾病或有并發(fā)癥、營養(yǎng)不良、厭食癥等其他疾病。

      1.4 標本收集及糞便DNA提取

      使用無菌采集管收集所有受試者糞便標本至實驗室進行分裝,取500 mg裝入無菌EP管中,轉運至-80℃冰箱凍存待檢。采用糞便DNA提取試劑盒(QIAGEN,德國)提取糞便細菌DNA,具體步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其基因組中是否含有雜質及降解成分并測定其大小和完整性;使用Nanodrop 分光光度計檢測DNA樣品濃度及純度。

      1.5 高通量測序

      基于美國Illumina 公司的MiSeq 測序儀(PE300),利用引物338F/806R 對提取的DNA 樣本16S rDNA V3~V4 高變區(qū)序列進行擴增,然后對擴增片段進行二代基因測序。

      1.6 統計學分析

      采用SPSS 22.0 統計軟件對數據進行統計學分析,計量資料以均數±標準差(±s)表示,兩組間比較采用兩樣本t檢驗,計數資料以百分率(%)表示,兩組間比較采用卡方檢驗,P<0.05 為差異有統計學意義。

      將測序獲得的原始數據導入QIIME2 軟件進行分析和處理,經過質量過濾后的序列以97%的同一性閾值被聚類到一個操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)中。基于Greengenes數據庫(version 13.8)將序列進行相似度匹配和物種鑒定,獲取每個物種的相對豐度。采用Alpha 分析、Beta分析、線性判別分析(linear discriminant analysis effect size,LEfSe),利用屬水平的物種豐度信息,分 別 使 用Mothur 軟 件(1.30.2)、Qiime 2 軟 件(1.9.1)、LEfSe 軟件進行兩組間差異物種檢測。Alpha分析、Beta分析檢測P<0.05,LEfSe的線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)值>2的物種即為組間差異有統計學意義的物種。

      2 結果

      2.1 一般資料

      本研究共納入FPIP 患兒31 例,其中男18 例,女13 例,年齡0~6 月齡,平均年齡(2.7±1.9)月齡;健康對照組31例,其中男17例,女14例,年齡0~6 月齡,平均年齡(2.5±1.4)月齡,兩組年齡(t=0.493,P=0.624)、 性 別(χ2=1.319,P=0.798)差異均無統計學意義。

      2.2 腸道菌群多樣性分析

      兩組糞便DNA 樣本經Illumina Miseq 平臺測序序列優(yōu)化后,共獲得3136284 條有效序列及1884242 條唯一序列,平均每份樣本序列數為30391條,測序深度均達到99%。經鑒定細菌來源20門、41綱、90目、151科、273屬、404種及522個OTU。Alpha 多樣性分析菌群多樣性(Shannon指數)和豐富度(Chao 指數)結果顯示,FPIP 組患兒腸道菌群多樣性Shannon 指數低于健康對照組,但差異無統計學意義(P>0.05);FPIP 組患兒腸道菌群豐富度Chao指數明顯高于健康對照組(P<0.01)。見表1。

      表1 FPIP組和健康對照組的菌群Alpha多樣性分析(±s)

      表1 FPIP組和健康對照組的菌群Alpha多樣性分析(±s)

      組別健康對照組FPIP組t值P值n 3131 Shannon指數1.4±0.51.2±0.41.2900.201 Chao指數64±3497±572.7810.007

      對兩組樣本行主坐標分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)探究樣本間腸道菌群相似性或差異性,采用組間差異檢驗(Adonis 檢驗)分析不同分組間差異是否存在統計學意義。結果顯示:健康對照組各樣本點間距離較小,提示組內腸道菌群構成較為相似,但FPIP 組各樣本點間距離較大,表明組內腸道菌群構成存在較大差異;且兩組樣本組間距離也較大,FPIP 組和健康對照組腸道菌群呈分離狀態(tài),提示兩組樣本在腸道菌群構成上差異明顯(R2=0.060,P=0.001)。見圖1。

      2.3 腸道菌群組成分析

      在菌群多樣性分析的基礎上對FPIP 組和健康對照組的菌群組成進行對比分析,兩組共有OTU 280個,FPIP組獨有OTU 150個,健康對照組獨有OTU 107個。對OTU進行聚類分析發(fā)現,在門水平上,兩組菌群均主要由厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門構成(圖2)。在屬水平上,FPIP組主要由大腸埃希氏菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、腸球菌屬、克雷伯氏菌屬和雙歧桿菌屬組成;健康對照組主要由雙歧桿菌屬、鏈球菌屬組成(圖3)。進一步通過Heatmap圖觀察兩組間腸道菌群組成及分布情況(圖4),在FPIP組中樣本5(78%)、8(84%)、9(82%)的腸球菌屬相對含量顯著高于其他樣本;健康對照組中樣本1(83%)、2(91%)、14(93%)、26(95%)的雙歧桿菌屬相對含量顯著高于其他樣本;此外,狹義的梭菌屬在FPIP 組 中 樣 本16 (69%)、17 (61%)、23(96%)中顯著富集;志賀氏菌屬在FPIP組中樣本15(87%)、19(62%)、29(67%)、34(55%)中顯著富集;提示腸球菌屬、雙歧桿菌屬、梭菌屬及志賀氏菌屬是兩組兒童腸道菌群變化的主要菌屬。

      2.4 腸道菌群物種差異分析

      對FPIP 組和健康對照組進行腸道菌群物種差異比較分析發(fā)現,在門水平上,與健康對照組相比,FPIP組中放線菌門(Actinobacteria)構成比顯著降低(P<0.001),變形菌門、梭桿菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和未知菌門(SBR1093)構成比明顯增加(P<0.05)(圖5);在屬水平上,與健康對照組相比,FPIP 組中雙歧桿菌屬和瘤胃球菌屬構成比明顯降低(P<0.05),梭狀芽孢桿菌屬和志賀氏菌屬構成比明顯增加(P<0.05)(圖6)。進一步行LEfSe 多級物種差異判別分析(從門到屬,LDA 閾值為3),顯示FPIP 組變形菌門、ν-變形菌綱、腸桿菌目、腸桿菌科、克雷伯氏菌屬、乳桿菌目等菌群豐度顯著高于健康對照組;放線菌門(綱)、芽孢桿菌綱、雙歧桿菌目(科、屬)及布勞特氏菌屬等菌群豐度顯著低于健康對照組(圖7)。

      3 討論

      FPIP 是食物過敏引起的一種消化道疾病,與本病相關的致敏原有牛奶、雞蛋、豆類、魚、小麥等,絕大多數患兒的實驗室檢查指標正常,皮膚點刺試驗和血清特異性IgE檢測呈陰性。腸道微生態(tài)在人類健康中發(fā)揮重要作用,研究顯示腸道菌群多樣性降低與1 歲以下嬰兒的過敏性疾病相關[8]。Zimmermann 等[9]報道嬰幼兒腸道菌群的多樣性降低可導致IgE介導過敏性疾病如濕疹及過敏性鼻炎等的發(fā)生率增加;另一項研究同樣也提示了IgE介導的特應性濕疹嬰兒總微生物群的多樣性較低[10]。上述研究證實腸道菌群多樣性的減少與IgE介導過敏性疾病相關。但腸道菌群多樣性與非IgE 介導的過敏性疾病的相關性報道較少,Berni Canani 等[11]研究發(fā)現非IgE 介導的牛奶過敏性疾病患兒與正常健康嬰兒腸道菌群多樣性無差異;FPIP作為非IgE介導的過敏性疾病之一,本研究對31例FPIP患兒和31例健康嬰兒進行腸道菌群多樣性分析。

      群落生態(tài)學中研究微生物多樣性,通過單樣品的多樣性分析(Alpha 多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性,包括一系列統計學指數估計群落的物種豐富度和多樣性。Alpha多樣性分析作為研究腸道菌群多樣性的重要方法之一,常用的 度 量 標 準 有Chao、Shannon、Ace、Simpson、Coverage 等指數。Chao 指數是用Chao1 算法估計樣品中所含的OTU 數目,利用Chao 指數評估一個樣本中OTU 數目多少,Chao 指數越大,OTU 數目越多,說明該樣本物種數比較多。Ace指數用來估計群落中的OTU 數目,是生態(tài)學中估計物種總數的常用指數之一,與Chao1 的算法不同。Shannon 指數用來估算樣品中的微生物多樣性,它與Simpson多樣性指數均常用于反映群落多樣性,Shannon 值越大,說明群落多樣性越高。Simpson 指數在生態(tài)學中常用來定量描述1 個區(qū)域的生物多樣性。Coverage指數是指各樣品文庫的覆蓋率,其數值越高,則樣品中序列被測出的概率越高,而沒有被測出的概率越低,該指數反映本次測序結果是否代表了樣品中微生物的真實情況。Alpha多樣性分析5 個指數中通常以Shannon 指數代表物種多樣性[12],Chao指數代表物種豐富度[13],因此本研究Alpha 多樣性分析僅展示Shannon 和Chao 指數。本研究菌群多樣性Shannon指數示FPIP組低于健康對照組,但差異無統計學意義,考慮與本研究納入樣本量少有關。FPIP 組菌群豐富度Chao 指數示FPIP 組明顯高于健康對照組,提示FPIP 組中OTU數目多于健康對照組。

      有研究顯示,嬰幼兒腸道菌群主要由擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門和變形菌門4 個菌門構成[14-15]。本研究對FPIP 組和健康對照組的菌群組成進行對比分析,兩組共有OTU 280 個,對OTU進行聚類分析發(fā)現,在門水平,兩組腸道菌群均主要由上述4 個菌門構成,門組成與健康嬰幼兒、IgE 介導[15]與非IgE 介導[1]過敏性疾病患兒一致。健康嬰幼兒腸道菌群中最多的是厚壁菌門和擬桿菌門,超過90%[16];厚壁菌門多為革蘭陽性菌,細胞壁含肽聚糖量高,具有維持腸道正常的營養(yǎng)、代謝和免疫功能[17];擬桿菌門為革蘭陰性菌,在分解多糖調節(jié)及促進腸道發(fā)育方面有重要的作用。最近一項研究顯示IgE介導的食物過敏兒童腸道菌群中擬桿菌門和厚壁菌門明顯增加[15];王和平等[18]通過濕疹患兒和健康嬰幼兒各10例進行腸道菌群對比分析示擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門和變形菌門構成無差異。本研究中FPIP 組患兒厚壁菌門和擬桿菌門較健康對照組稍高,但差異無統計學意義,考慮與本研究樣品量少有關。

      近來研究顯示非IgE介導的過敏性疾病的腸道菌群失衡主要表現為變形菌門明顯增加[19],本研究中與正常健康嬰兒相比,非IgE介導的FPIP患兒腸道菌群中變形菌門顯著增加,放線菌門明顯減少。放線菌門是絲狀革蘭陽性菌,在有機物質分解中發(fā)揮重要作用,主要參與合成代謝產物,如抗生素、色素、酶抑制劑和生物技術相關酶等,本研究中FPIP 患兒腸道菌群放線菌門明顯減少,且在此門屬下,雙歧桿菌屬明顯減少;雙歧桿菌在母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒腸道菌群中占99%[20],作為黏附于腸黏膜上皮的有益菌,特別是黏附于結腸黏膜上皮的雙歧桿菌可以消耗人乳中復雜寡糖,而使其成為母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道中最豐富的定植者;本研究結果提示FPIP 的發(fā)生伴隨有益菌雙歧桿菌的減少。變形菌門屬于革蘭陰性桿菌,是腸道菌群常見兼性厭氧菌,在健康嬰兒體內較厚壁菌門和放線菌門豐度少,在人體內含量小于1%,多為致病菌,研究發(fā)現變形菌門豐度增高可作為腸道菌群紊亂的標志[21]。本研究中FPIP 組患兒腸道菌群中變形菌門較健康對照組明顯增多,同時在此門屬下,FPIP 組中志賀氏菌屬和梭狀芽孢桿菌屬水平明顯高于健康對照組。以上結果提示FPIP 患兒腸道菌群結構可能存在失調的情況,主要以雙歧桿菌含量下降、志賀氏菌屬和梭狀芽孢桿菌增加為主。

      本研究提示FPIP 與腸道菌群有一定關系,腸道菌群失調可能影響其發(fā)病和轉歸,但目前這種因果關系仍無定論。因此可能需更進一步研究探討兩者的關系,從而為FPIP 的診治提供更多臨床參考。

      利益沖突聲明:所有作者聲明不存在利益沖突關系。

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