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      重組人腦利鈉肽對慢性心衰大鼠免疫和FAK、Bax、Bcl-2、p53的影響及相關(guān)性分析

      2022-11-15 09:03:02劉培君康秀峰雷曉亭洪志斌天水市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科天水741000
      中國免疫學(xué)雜志 2022年17期
      關(guān)鍵詞:呋塞利鈉人腦

      劉培君 康秀峰雷曉亭洪志斌(天水市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科,天水 741000)

      慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是由多種原因引起的心肌損傷,導(dǎo)致患者充盈功能低下,發(fā)病早期癥狀不明顯,臨床多表現(xiàn)為乏力、呼吸困難及體液潴留等。近年來,CHF的發(fā)生率呈上升趨勢,且五年存活率與惡性腫瘤相近,影響患者健康生活[1-2]。既往研究表明,CHF的發(fā)生、發(fā)展常伴有心肌細(xì)胞凋亡,呋塞米屬于臨床常用藥物,雖然能延緩病情發(fā)展,但遠(yuǎn)期預(yù)后較差,不良反應(yīng)發(fā)生率較高,導(dǎo)致臨床使用受限[3]。重組人腦利鈉肽屬于人體分泌的一種內(nèi)源性多肽,重組DNA技術(shù)利用大腸桿菌凍干制劑能與心室肌產(chǎn)生的內(nèi)源性腦利鈉肽具有相同的氨基酸序列[4-5]。同時,藥物能拮抗心肌細(xì)胞、心纖維原細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)皮素,有助于提高腎小球?yàn)V過率,促進(jìn)鈉的排泄[6]。因此,本研究以SD大鼠為研究對象,探討重組人腦利鈉肽在慢性心衰大鼠中的作用機(jī)制及對黏著斑激酶(FAK)、Bcl-2相關(guān)C蛋白(Bax)、心肌組織凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)及抑癌基因p53(p53)的影響報道如下。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物健康清潔級SD大鼠40只,雌雄隨機(jī),體質(zhì)量220~280 g,平均(250.00±20.00)g,隨機(jī)取10只設(shè)為空白對照組;剩余30只復(fù)制大鼠CHF動物模型,建模成功后隨機(jī)分為模型對照組、呋塞米組和重組人腦利鈉肽組,10只/組。動物合格證號:SCXX-2005-0001,所選動物均購于實(shí)驗(yàn)動物房,完成大鼠的常規(guī)喂養(yǎng)、光照。

      1.1.2 主要試劑與儀器注射用苯巴比妥鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司);鹽酸多柔比星,規(guī)格:10 mg/支(山西普德藥業(yè)股份有限公司);ELISA試劑盒(美國R&D Systems公司);BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);凍干重組人腦利鈉肽,規(guī)格:0.5 mg×1瓶/盒(成都諾迪康生物制藥有限公司);內(nèi)參抗體β-actin(美國Sigma公司);大鼠飼養(yǎng)籠(西安交通大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心);超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);小動物超聲儀,型號Vevo770型(Visuslsonics公司);臺式高速低溫離心機(jī)(德國Herolab公司)。

      1.2 方法

      1.2.1 建模與分組

      1.2.1.1 建模剩余30只大鼠采用鹽酸多柔比星隔日腹腔注射法復(fù)制大鼠CHF動物模型,具體方法如下:給藥劑量依次為第1、3天劑量為1 mg/kg、第5、7天劑量為2 mg/kg、第9、11天劑量為3 mg/kg、第13、15天劑量為4 mg/kg,連續(xù)完成8次給藥,累計(jì)劑量為20 mg/kg。上述操作完畢后對大鼠連續(xù)完成3周喂養(yǎng),并完成其生命體征監(jiān)測。左心室質(zhì)量/體質(zhì)量為左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI),右心室質(zhì)量/體質(zhì)量為右心室質(zhì)量指數(shù)(RVMI),左心室肌HE染色,并配合大鼠的行為、體征判斷造模標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。

      1.2.1.2 分組建模成功后隨機(jī)分為模型對照組、呋塞米組和重組人腦利鈉肽組,10只/組。處理方法:空白對照組與模型對照組給予等劑量生理鹽水;呋塞米組采用呋塞米溶液[10 mg/(kg·d)]灌胃干預(yù),重組人腦利鈉肽組采用重組人腦利鈉肽溶液[15μg/(kg·d)]皮下注射4周。

      1.2.2 觀察指標(biāo)

      1.2.2.1 心功能水平采用超聲心動圖檢測大鼠心功能水平,包括左室舒張期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮期內(nèi)徑(LVIDs)、射血分?jǐn)?shù)(EF)及短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS)水平的測定[9]。

      1.2.2.2 免疫水平4組大鼠干預(yù)后4周以斷頸方式處死,取頸動脈血3 ml,流式細(xì)胞儀完成CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的水平測定[10-11]。

      1.2.2.3 FAK、Bax、Bcl-2及p53水平4組大鼠處理4周后以斷頸方式處死,取心肌組織100 mg,向組織中加入1 ml裂解液完成組織裂解,12 000 r/min離心15 min。取上清,根據(jù)BCA法完成相關(guān)蛋白濃度測定;沸水浴變性,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂牛奶封閉,分別加入FAK、Bax、Bcl-2及p53蛋白一抗,孵育過夜后加入二抗,并以化學(xué)發(fā)光法顯色,膠片曝光后顯影[12-13]。

      1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS18.0軟件處理,計(jì)量資料行t檢驗(yàn),采用±s表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 各組心功能比較重組人腦利鈉肽組和呋塞米組心功能LVIDd、LVIDs水平低于模型對照組(P<0.05);EF及FS水平高于模型對照組(P<0.05);重組人腦利鈉肽組干預(yù)4周后LVIDd、LVIDs水平低于呋塞米組(P<0.05);EF及FS水平高于呋塞米組(P<0.05),見表1。

      表1 4組心功能比較(±s)Tab.1 Comparison of cardiac function among four groups(±s)

      表1 4組心功能比較(±s)Tab.1 Comparison of cardiac function among four groups(±s)

      Note:Compared with blank control group,1)P<0.05;compared with model control group,2)P<0.05;compared with furosemide group,3)P<0.05.

      Groups Recombinant human brain natriuretic peptide Furosemide Model control Blank control n 10 10 10 10 LVIDd/mm 9.59±1.781)2)3)10.73±2.111)2)11.21±2.151)8.48±0.62 LVIDs/mm 6.84±1.591)2)3)8.43±2.061)2)10.26±2.611)5.31±0.84 EF(%)54.39±4.741)2)3)43.34±3.791)2)22.49±2.131)64.59±5.62 FS(%)30.32±3.891)2)3)21.59±3.381)2)10.49±2.421)35.63±4.30

      2.2 各組免疫水平比較重組人腦利鈉肽組和呋塞米組CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平高于模型對照組(P<0.05);CD8+水平低于模型對照組(P<0.05);重組人腦利鈉肽組干預(yù)4周后CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平高于呋塞米組(P<0.05);CD8+水平低于呋塞米組(P<0.05),見表2。

      表2 4組免疫水平比較(±s,%)Tab.2 Comparison of immune levels among four groups(±s,%)

      表2 4組免疫水平比較(±s,%)Tab.2 Comparison of immune levels among four groups(±s,%)

      Note:Compared with blank control group,1)P<0.05;compared with model control group,2)P<0.05;compared with furosemide group,3)P<0.05.

      Groups Recombinant human brain natriuretic peptide Furosemide Model control Blank control n 10 10 10 10 CD3+58.43±4.311)2)3)49.68±3.691)2)45.71±2.491)63.29±4.59 CD4+42.14±3.111)2)3)37.39±3.171)2)34.21±2.491)46.49±3.23 CD8+29.53±4.521)2)3)32.23±4.391)2)35.45±5.791)27.29±3.23 CD4+/CD8+1.43±0.231)2)3)1.16±0.161)2)0.97±0.111)1.70±0.27

      圖2 各組FAK、Bax、Bcl-2及p53蛋白表達(dá)量Fig.2 Expressions of FAK,Bax,Bcl-2 and p53 protein in each groups

      2.3 各組FAK、Bax、Bcl-2及p53水平比較BCA法測定結(jié)果表明,重組人腦利鈉肽組和呋塞米組FAK、Bax、p53水平低于模型組(P<0.05);Bcl-2水平高于模型組(P<0.05);重組人腦利鈉肽組FAK、Bax、p53水平低于呋塞米組(P<0.05);Bcl-2水平高于呋塞米組(P<0.05),見圖1、2。

      圖1 4組FAK、Bax、Bcl-2及p53相對表達(dá)量比較Fig.1 Comparison of relative expressions of FAK,Bax,Bcl-2 and p53 in four groups

      3 討論

      目前,臨床上對于CHF的發(fā)病機(jī)制尚未闡明,而心肌細(xì)胞凋亡在疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14]。既往研究表明,心肌細(xì)胞凋亡是引起心功能不全的重要原因,在整個疾病中發(fā)揮重要作用,且心力衰竭越嚴(yán)重,心肌細(xì)胞凋亡數(shù)越多[15]。利鈉肽屬于心力衰竭患者體內(nèi)最為重要的神經(jīng)內(nèi)分泌激素之一,而重組人腦利鈉肽的使用可作為人體應(yīng)激大量產(chǎn)生的補(bǔ)充代償機(jī)制[16]。本研究中,重組人腦利鈉肽組干預(yù)后4周LVIDd、LVIDs水平低于呋塞米組;EF及FS水平高于呋塞米組,提示重組人腦利鈉肽的干預(yù)可改善大鼠心功能水平,利于大鼠恢復(fù)。重組人腦利鈉肽可通過降低動脈與靜脈壓力,增加心輸出量,抑制神經(jīng)激素激活水平,從而影響機(jī)體血流動力學(xué)。由于重組人腦利鈉肽對于機(jī)體的作用決定了其激動劑在臨床上的應(yīng)用及發(fā)作,其廣泛應(yīng)用于心力衰竭的治療[13]?,F(xiàn)代藥理結(jié)果表明,重組人腦利鈉肽是利用DNA技術(shù)合成的生物制劑,并以大腸桿菌為生成菌種,具有較高的純度,且與內(nèi)源性BNP具有相同的生物活性[17]。同時,重組人腦利鈉肽亦可發(fā)揮中度利尿作用,能增加腎小球系膜細(xì)胞含量,擴(kuò)張腎臟入球的小動脈,有助于提高腎臟腎小球?yàn)V過率,改善機(jī)體免疫水平。本研究中,重組人腦利鈉肽組干預(yù)4周后CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平高于呋塞米組;CD8+水平低于呋塞米組,提示重組人腦利鈉肽可改善CHF大鼠免疫水平,提高機(jī)體的抗病能力,減輕腎臟組織損傷,利于大鼠恢復(fù)。

      現(xiàn)代藥理結(jié)果表明,F(xiàn)AK是胞內(nèi)外信號出入的中樞,可介導(dǎo)多條信號通路,整合源于整合素、生長因子及機(jī)械刺激的信號,參與細(xì)胞的生長、調(diào)節(jié),在CHF的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用;Bcl-2是癌基因的一種,具有抑制細(xì)胞凋亡作用,能抑制由多種細(xì)胞毒因素引起的細(xì)胞凋亡。既往研究表明,Bcl-2能增強(qiáng)細(xì)胞對多數(shù)DNA損傷因子發(fā)揮良好的抵抗性,但難以促進(jìn)DNA修復(fù)[18]。而p53蛋白屬于DNA損傷的分子傳感器,Bcl-2能抑制p53介導(dǎo)的凋亡,參與CHF的發(fā)生。Bax屬于兔抗人單克隆抗體,過度表達(dá)的Bax會對Bcl-2產(chǎn)生影響,加速細(xì)胞凋亡[19]。本研究中,重組人腦利鈉肽組FAK、Bax、p53水平低于呋塞米組;Bcl-2水平高于呋塞米組,提示重組人腦利鈉肽可改善FAK、Bax、p53、Bcl-2水平,為CHF的治療提供新的思路和方法。既往研究表明,CHF的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素過程,常伴有免疫水平異常,能引起T淋巴細(xì)胞水平異常。通過比較CHF與非CHF患者FAK、Bax、p53、Bcl-2水平發(fā)現(xiàn),T淋巴細(xì)胞與FAK、Bax、p53、Bcl-2表達(dá)水平存在緊密聯(lián)系,加強(qiáng)FAK、Bax、p53、Bcl-2水平測定可反映、評估機(jī)體免疫狀態(tài),指導(dǎo)臨床治療。

      綜上所述,重組人腦利鈉肽用于CHF大鼠中有助于提高其心功能水平,改善機(jī)體免疫水平,降低FAK、Bax、p53水平,提高Bcl-2水平,可為慢性心衰治療提供參考依據(jù)。

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