肺腺癌中成纖維細胞亞群臨床及免疫特征的生物信息學(xué)分析①

劉鳳森 平 玉 張 毅（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心，鄭州 450052）

相關(guān)研究表明，腫瘤相關(guān)成纖維細胞在腫瘤進展、化療及免疫治療耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1］。腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）作為肺癌基質(zhì)中較關(guān)鍵的細胞成分，通過分泌多種細胞因子等方式參與細胞外基質(zhì)重塑以及形成免疫抑制微環(huán)境，促進肺腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移［2-4］。然而，由于肺癌患者中CAFs起源于不同的祖細胞，腫瘤中的CAFs亞群可能具有較大的異質(zhì)性，導(dǎo)致其功能及作用機制具有一定的差異性。近期，LAMBRECHTS等［5］在自然醫(yī)學(xué)雜志發(fā)表的文章揭示CAFs主要由7種不同的成纖維細胞亞群組成。單細胞測序分析顯示其中6種成纖維細胞亞群表達特征性基因標志物。盡管目前多項研究表明成纖維細胞在化療及免疫治療耐藥中發(fā)揮重要作用，然而肺腺癌中不同成纖維細胞亞群的臨床意義及其對應(yīng)的免疫學(xué)效應(yīng)尚未明確［3］。本文結(jié)合單細胞測序得到6種成纖維細胞亞群的基因標志物，探究不同成纖維細胞亞群對應(yīng)的臨床意義及免疫學(xué)效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)不同成纖維細胞亞群介導(dǎo)了不同的免疫效應(yīng)及臨床效應(yīng)。因此，本研究很可能為肺腺癌的免疫治療及精準治療提供新的切入點［6］。

1 資料與方法

1.1 資料本研究納入的肺腺癌患者樣本均來自TCGA數(shù)據(jù)庫（http：//cancerge-nome.Nih.gov/），TCGA是目前最大的癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫，是由美國國家癌癥研究所（National Cancer Institute）和美國人類基因組研究所（National Human Genome Research Institute）共同監(jiān)督的一個項目。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中提取了肺腺癌患者的數(shù)據(jù)信息，包括513例患者的遺傳信息數(shù)據(jù)（mRNA）和對應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)（性別、轉(zhuǎn)移狀態(tài)、腫瘤分期、吸煙史、生存狀態(tài)、隨訪時間）。

1.2 方法

1.2.1 成纖維細胞亞群浸潤分析結(jié)合LAMBRECHTS等［5］分析得到的6種成纖維細胞亞群的標志基因，利用R軟件對TCGA中的肺腺癌患者的mRNAseq數(shù)據(jù)（TPM格式）進行了ssGSEA分析，由此得到了6種成纖維細胞在腫瘤中浸潤的相對比例。ssGSEA在原理上與GSEA是類似的，是根據(jù)表達譜文件計算每個基因的排序值，再進行后續(xù)的統(tǒng)計分析。通過此方法，能夠得到每個樣本的某種細胞或者某種通路的相對活性值。

1.2.2 細胞浸潤分析利用R軟件對TCGA中的肺腺癌患者的mRNAseq數(shù)據(jù)（TPM格式）進行了xCell分析（64種細胞浸潤分析），由此得到了64種免疫相關(guān)細胞在腫瘤中浸潤的相對豐度。肺腺癌患者的細胞毒性因子評分和nTreg細胞浸潤評分由ImmuneCellAI數(shù)據(jù)庫（http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/web/ImmuCellAI/）下載得到。

1.2.3 預(yù)測免疫治療應(yīng)答的生物標志物通過腫瘤突變負荷（TMB）、新抗原數(shù)目、PD-L1蛋白表達水平、腫瘤免疫功能障礙與排斥（TIDE）評分和腫瘤干性評分評估不同成纖維細胞亞群的免疫學(xué)相關(guān)效應(yīng)。肺腺癌患者的TMB和新抗原數(shù)據(jù)是從癌癥免疫圖譜數(shù)據(jù)庫（https：//tcia.at/home）中下載得到的。PD-L1蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù)是從生物信息學(xué)門戶網(wǎng)站（http：//www.cbioportal.org）中下載得到的。TIDE評分已被證明在預(yù)測黑色素瘤和肺癌患者的免疫治療反應(yīng)方面優(yōu)于已知的免疫治療生物標志物。從TIDE網(wǎng)站（http：//tide.dfci.harvard.edu）下載了肺腺癌患者的TIDE評分、T細胞功能障礙評分和T細胞排斥評分等。干性評分由干性基因集，經(jīng)ssGSEA分析計算得到［7］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用Kaplan-Meier曲線和Logrank檢驗，計算高危組和低危組成纖維細胞亞群的預(yù)后意義。根據(jù)“Survminer”R包的“surv_cutpoint”函數(shù)，將肺腺癌患者中的所有患者按最佳截斷點分為高風險組和低風險組。Wilcoxon檢驗比較不同成纖維細胞亞群的組間差異。Spearman分析計算連續(xù)變量間的相關(guān)性。在所有統(tǒng)計方法中，P＜0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。R軟件版本3.6.1（https：//www.r-project.org）用于上述數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床病理資料的分布特征下載TCGA肺腺癌患者表達譜數(shù)據(jù)，得到513份樣本數(shù)據(jù)。排除臨床特征缺失值較多的患者后，納入下游分析507例TCGA肺腺癌患者，其中T1（171例）、T2（268例）及M0（335例）期患者較多，多數(shù)患者有吸煙史，并大致呈正態(tài)分布?；颊吲R床特征數(shù)據(jù)，見表1。

表1 TCGA肺腺癌患者的臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of TCGA patients with lung adenocarcinoma

2.2 不同成纖維細胞亞群的基因標志物及其在TCGA肺腺癌患者中的浸潤分布特征成纖維細胞亞群的浸潤分布特征，見圖1?？梢园l(fā)現(xiàn)，不同患者的各成纖維細胞分布比例具有較大異質(zhì)性，較多患者的整體成纖維細胞豐度相對較高，較少患者的整體成纖維細胞豐度相對較低。成纖維細胞亞群的標志基因，見表2。

表2 成纖維細胞亞群的標志性基因Tab.2 Marker genes of fibroblast subpopulations

圖1 6種成纖維細胞亞群在513例肺腺癌患者中的浸潤分布Fig.1 Infiltration distribution of 6 kinds of fibroblast subpopulations in 513 patients with lung adenocarcinoma

2.3 成纖維細胞亞群和臨床指標的相關(guān)性如圖2，與男性患者相比，第5、6亞群成纖維細胞更多富集在女性患者（第5亞群P=0.004 6，第6亞群P=0.002 9），這提示不同的激素對成纖維細胞的浸潤可能有一定的影響。此外，隨著吸煙時間的延長，腫瘤內(nèi)第6亞群的比例呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢（P＜0.05）。第6亞群的浸潤豐度在早期腫瘤中更高，這表明第6亞群可能抑制了腫瘤細胞的惡性進展（P＜0.05）。另外，與腫瘤轉(zhuǎn)移患者相比，第1、2亞群顯著富集在未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者（第1亞群P=0.029，第2亞群P=0.021），提示成纖維細胞可能在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮“柵欄”作用，抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。

圖2 成纖維細胞亞群和臨床病理指標的相關(guān)性Fig.2 Correlation between fibroblast subpopulations and clinicopathological indicators

2.4 成纖維細胞亞群的預(yù)后價值 不同成纖維細胞亞群對患者的預(yù)后影響均不相同，其中第5、7亞群是患者的風險性預(yù)后因子（第5亞群P＜0.001，第7亞群P＜0.001），第6亞群是患者的保護性預(yù)后因子（第6亞群P=0.001 4），其他亞群無顯著性差異，無預(yù)后意義，見圖3。

圖3 6種成纖維細胞亞群在513例肺腺癌患者中的生存曲線Fig.3 Survival curves of 6 kinds of fibroblast subpopulations in 513 patients with lung adenocarcinoma

2.5 第6亞群成纖維細胞和多種免疫相關(guān)細胞成分的相關(guān)性第6亞群成纖維細胞與免疫浸潤評分（r=0.347）、淋巴內(nèi)皮細胞評分（r=0.539）、內(nèi)皮細胞評分（r=0.583）、細胞毒性因子評分（r=0.131）、中心記憶CD8+T細胞評分（r=0.104）均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與自然調(diào)節(jié)性T細胞（r=-0.489）呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），見圖4。

圖4 第6亞群成纖維細胞和免疫相關(guān)標志物的比較Fig.4 Comparison between sixth subgroup fibroblasts and immune-related markers

2.6 成纖維細胞亞群和免疫治療反應(yīng)標志物的相關(guān)性成纖維細胞亞群和抗原提呈及免疫檢查點標志物呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，圖5A、B）。第1亞群和TMB及新抗原克隆數(shù)量呈正相關(guān)（P＜0.05），而第2、6亞群和TMB及新抗原克隆數(shù)量呈負相關(guān)（P＜0.05）；除第2、6亞群外，其他4群和PDL1蛋白表達均呈正相關(guān)（P＜0.05，圖5C）。這意味著成纖維細胞亞群在腫瘤微環(huán)境中的多種免疫過程中發(fā)揮重要作用。

圖5 成纖維細胞亞群和免疫治療反應(yīng)標志物的相關(guān)性Fig.5 Correlation between fibroblast subpopulations and immunotherapy response markers

2.7 成纖維細胞亞群和免疫治療耐藥評分及腫瘤干性評分的相關(guān)性如圖6，比較了TIDE系統(tǒng)評分及腫瘤干性評分和各個成纖維細胞亞群的相關(guān)性。除第6亞群外，其他5群均與免疫治療耐藥評分（P＜0.01）和腫瘤干性評分（P＜0.05）呈正相關(guān)，表明成纖維細胞亞群可能參與形成了免疫抑制微環(huán)境，以及參與維持腫瘤干性環(huán)境，而第6亞群可能抑制了腫瘤干性微環(huán)境的形成。

圖6 成纖維細胞亞群和免疫治療耐藥評分及腫瘤干性評分的相關(guān)性Fig.6 Correlation of fibroblast subpopulations with immunotherapy resistance score and tumor stemness score

3 討論

從TCGA數(shù)據(jù)庫下載了肺腺癌患者的基因表達數(shù)據(jù)及臨床病理數(shù)據(jù)，共納入513例患者進行分析。在進行病理指標分析時，排除了6例含缺失值較多的患者進行下游分析。本課題組發(fā)現(xiàn)，肺腺癌中成纖維細胞亞群參與了腫瘤微環(huán)境中的多種免疫過程［8-9］。不同亞群的成纖維細胞介導(dǎo)了不同的免疫學(xué)效應(yīng)和腫瘤學(xué)效應(yīng)，具有不同的預(yù)后意義［10］。其中第6亞群（標志基因：FIGF、PDPN和PROX1等）與腫瘤的T分期及患者吸煙時長密切相關(guān)，具有良好的預(yù)后意義。進一步結(jié)合免疫相關(guān)細胞浸潤分析，發(fā)現(xiàn)第6亞群成纖維細胞與腫瘤微環(huán)境中的脈管系統(tǒng)相關(guān)免疫評分（免疫浸潤評分、淋巴內(nèi)皮細胞評分、內(nèi)皮細胞評分和中心記憶CD8T細胞評分）具有顯著正相關(guān)，這意味著它可能促進并維持腫瘤免疫微環(huán)境。這促使探究成纖維細胞亞群是否參與維持了免疫治療耐藥和腫瘤干性［11］。第6亞群細胞未參與免疫治療耐藥，但是可能抑制了腫瘤干性微環(huán)境的形成，而其他亞群成纖維細胞均不同程度地介導(dǎo)了免疫治療耐藥并參與維持腫瘤干性微環(huán)境。

既往研究普遍認為成纖維細胞促進免疫抑制微環(huán)境的形成，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展甚至轉(zhuǎn)移［12-13］。然而分析結(jié)果提示肺腺癌中成纖維細胞亞群有著不同的臨床意義，如第6亞群的高浸潤提示患者預(yù)后更好。鑒于第6亞群成纖維細胞的特殊臨床意義，發(fā)現(xiàn)它特征性地表達FIGF基因，即血管內(nèi)皮生長因子D。該生長因子常高表達于血管生成、淋巴管生成和內(nèi)皮細胞生長階段，促進淋巴管、血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，并對血管通透性及淋巴內(nèi)皮細胞的維持有一定影響［14］。然而血管及淋巴管的生成對腫瘤免疫微環(huán)境的形成有重要作用［15］。進一步來說，腫瘤相關(guān)脈管系統(tǒng)的存在促進了免疫細胞的浸潤，為化療及免疫治療的藥物遞送提供途徑，這很可能是癌癥治療新的切入點［16］。結(jié)合第6亞群成纖維細胞和細胞毒CD8+T細胞的相關(guān)性結(jié)果，可以認為第6亞群成纖維細胞很可能促進并維持了瘤內(nèi)脈管系統(tǒng)的功能，其為抗瘤免疫細胞及藥物進入瘤內(nèi)鋪平道路。另外，第6亞群成纖維細胞和腫瘤干性評分的相關(guān)性結(jié)果提示，腫瘤脈管系統(tǒng)的活躍很可能抑制了腫瘤干性微環(huán)境的形成及維持。而對于其他亞群的成纖維細胞，類似于既往的研究，結(jié)果表明他們更多地參與了免疫治療耐藥及腫瘤干性的特征維持［17-18］。

總之，本研究強調(diào)了肺腺癌中成纖維細胞亞群的異質(zhì)性組成，不同類型的成纖維細胞對患者的預(yù)后及免疫治療效果的影響不同［2］。這突出了精準治療的必要性：一方面，對于免疫抑制性的成纖維細胞，通過精準靶向消除，可以解除它們的免疫抑制作用；另一方面，對于免疫促進性的成纖維細胞，積極采取多種方法提高其在腫瘤微環(huán)境中的權(quán)重，可以為抗瘤免疫細胞浸潤及藥物遞送開辟途徑?；蛟S促使免疫抑制性的成纖維細胞向免疫促進性的成纖維細胞轉(zhuǎn)化，是未來的腫瘤治療方向。