活細(xì)胞內(nèi)鄰近標(biāo)記技術(shù)的研究進(jìn)展

葛陽(yáng)陽(yáng)，丁 明

（中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009）

蛋白質(zhì)通常形成復(fù)合物并產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性至關(guān)重要的相互作用網(wǎng)絡(luò)，無(wú)論是細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)還是新陳代謝，蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)在細(xì)胞機(jī)制的各個(gè)層面都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。生物功能的執(zhí)行和人類疾病的進(jìn)展都與蛋白質(zhì)相互作用（Protein-Protein Interactions，PPI）密切相關(guān)。而蛋白質(zhì)相互作用的失調(diào)與多種人類疾病有關(guān)，包括癌癥、免疫疾病和神經(jīng)退行性疾病。全面了解蛋白質(zhì)相互作用可為治療腫瘤提供理論依據(jù)。蛋白質(zhì)相互作用是一種動(dòng)態(tài)的調(diào)控，會(huì)受到多種因素的影響，如細(xì)胞周期的改變、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變等，具有瞬時(shí)及弱相互作用的特點(diǎn)。這些特點(diǎn)對(duì)研究蛋白質(zhì)相互作用造成了重大挑戰(zhàn)。

傳統(tǒng)研究蛋白質(zhì)相互作用的方法是親和純化和酵母雙雜交[1-2]，但是這2種方式適合研究穩(wěn)定的蛋白質(zhì)相互作用，比如親和純化會(huì)在細(xì)胞裂解和隨后的洗滌步驟中導(dǎo)致弱或短暫的相互作用通常會(huì)丟失，然而酵母雙雜交不適合研究膜蛋白，并且存在著高假陽(yáng)性結(jié)果。接近標(biāo)記技術(shù)（Proximity Labeling，PL）是為彌補(bǔ)這些傳統(tǒng)方法在研究蛋白質(zhì)相互作用的缺陷上開(kāi)發(fā)出來(lái)。鄰近標(biāo)記技術(shù)是使用工程酶，例如工程抗壞血酸過(guò)氧化物酶或生物素連接酶，在感興趣的蛋白（誘餌蛋白）上融合這些工程酶，酶將惰性小分子底物轉(zhuǎn)化為短壽命的活性物質(zhì)，從酶活性位點(diǎn)擴(kuò)散出來(lái)以共價(jià)標(biāo)記相鄰的內(nèi)源蛋白，從而研究蛋白質(zhì)相互作用。本文將介紹目前鄰近標(biāo)記技術(shù)在蛋白質(zhì)相互作用中的研究進(jìn)展。

1 鄰近標(biāo)記技術(shù)分類

1.1 BioID

BioID是在2012年發(fā)現(xiàn)并推出，該方法利用BirA生物素連接酶的天然能力對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行生物素化[3]。大腸桿菌中提取到這個(gè)酶，發(fā)現(xiàn)該酶在ATP和生物素存在的情況下，會(huì)產(chǎn)生活性物質(zhì)biotin-AMP，然后活性物質(zhì)會(huì)轉(zhuǎn)移到鄰近靶蛋白的表面的伯胺賴氨酸上。為了更廣泛地標(biāo)記附近的蛋白質(zhì)，第一代BioID使用BirA*（R118G）。與BirA相比，BirA*對(duì)biotin-AMP的親和力較低，這可以在10 nm半徑內(nèi)釋放更多的活性物質(zhì)，更好地對(duì)周圍蛋白質(zhì)進(jìn)行生物素化[4]。BioID需要相對(duì)較長(zhǎng)的標(biāo)記時(shí)間，以清楚地標(biāo)記相互作用的蛋白。在2016年，KIM等[5]提出了基于Aquifex aeolicus發(fā)現(xiàn)的BioID2（R40G），它缺少了DNA結(jié)合區(qū)域，因此分子量要比BioID小8 kDa，從而可能最大限度地減少對(duì)誘餌蛋白的功能干擾。BioID2與BioID相比顯示出更高的活性并且需要更少的生物素。同樣，BASU是一種來(lái)自Bacillussubtilis的BirA，與BioID和BioID2相比，具有更高的生物素化活性[6]。與BioID2一樣，BASU缺少N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且分子量比BioID小。

1.2 BioID突變體

研究者為進(jìn)一步提高BioID酶的活性，通過(guò)使用基于酵母展示的定向進(jìn)化，設(shè)計(jì)了2種增強(qiáng)的BioID變體：35 kDa TurboID和28 kDa miniTurbo[7]。最后，這些變體顯示出顯著的標(biāo)記能力，將標(biāo)記時(shí)間從16～18 h縮短到10 min，其大小和特異性與BioID相似。此外，與BioID和BioID2蛋白相比，TurboID和miniTurbo的鄰近標(biāo)記活性在不同的pH范圍和低溫下是穩(wěn)定的[7]。有趣的是，研究者將BioA*酶分為2個(gè)片段而開(kāi)發(fā)出Split-BioID方法。Split-BioID可以用于研究二聚化依賴性蛋白質(zhì)相互作用，將BirA*分為2個(gè)片段，分別連接到2個(gè)相互作用的蛋白上，在2個(gè)相互作用的蛋白靠近形成蛋白質(zhì)復(fù)合體時(shí)，BirA*重新組裝恢復(fù)活性從而生物素化底物和其他鄰近蛋白質(zhì)[8]。

1.3 APEX

2013年開(kāi)發(fā)出APEX方法，該方法基于與BioID相同的原理[9]。它使用一種與BioA*不同的酶——單體抗壞血酸過(guò)氧化物酶，對(duì)誘餌蛋白質(zhì)附近的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物素化。原理是在過(guò)氧化氫存在下，該酶將生物素-苯酚氧化為生物素苯氧基，這是一種半衰期短的自由基，會(huì)與富含電子的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、組氨酸和半胱氨酸）發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，在誘餌蛋白質(zhì)周圍約20 nm的半徑內(nèi)標(biāo)記蛋白，標(biāo)記反應(yīng)可以通過(guò)去除H2O2和添加淬滅緩沖液來(lái)停止，隨后可以使用鏈霉親和素珠分離得到的生物素化蛋白質(zhì)，并通過(guò)MS進(jìn)一步分析。APEX技術(shù)與第一代BioID技術(shù)的主要區(qū)別在于生物素化蛋白質(zhì)所需的孵育時(shí)間。由于過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞的毒性，隨后開(kāi)發(fā)了第二代APEX（A134P）以提高酶的催化效率，減少因暴露于過(guò)氧化氫而引起的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，并允許對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)的較低表達(dá)水平進(jìn)行研究[10]。與BioID技術(shù)相比，APEX酶活性更高，所標(biāo)記的蛋白數(shù)量更多，但是暴露于過(guò)氧化氫還可以通過(guò)激活信號(hào)通路以響應(yīng)氧化應(yīng)激、細(xì)胞器動(dòng)力學(xué)或整個(gè)蛋白質(zhì)相互作用來(lái)改變細(xì)胞的生理機(jī)能，出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。與BioID相同，APEX技術(shù)也擴(kuò)展到利用互補(bǔ)進(jìn)行鄰近標(biāo)記的Split-APEX技術(shù)，原理與Split-BioID相同。

1.4 PUP-IT技術(shù)

除了上述3中鄰近標(biāo)記技術(shù)以外，研究者還開(kāi)發(fā)了一種使用細(xì)菌Paf A酶的新鄰近標(biāo)記技術(shù)——PUP-IT[11]。與使用BioID和APEX不同，PUP-IT使用稱為Pup的小蛋白質(zhì)標(biāo)記蛋白質(zhì)。將PafA與誘餌蛋白融合，隨后會(huì)將Pup連接到附近的任何賴氨酸殘基上，從而發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白，使其成為一種潛在有用的鄰近標(biāo)記酶。

2 鄰近標(biāo)記的應(yīng)用

2.1 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

近年來(lái)，鄰近標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越多地被應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的研究。BioID最初是為研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的體內(nèi)核lamin-A而開(kāi)發(fā)的[3]?，F(xiàn)如今BioID已成功應(yīng)用于多種細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，BioID被應(yīng)用于探測(cè)不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，例如核孔復(fù)合物、線粒體和中心體-纖毛界面等。CHOU等[12]使用BioID來(lái)識(shí)別TDP43聚集體的相互作用物，TDP43聚集體是神經(jīng)退行性疾病的常見(jiàn)組織病理學(xué)標(biāo)志物，包括肌萎縮側(cè)索硬化和額顳葉癡呆。通過(guò)將BioID與TDP43融合以進(jìn)行鄰近標(biāo)記技術(shù)，研究者確定了核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。后續(xù)研究還表明，TDP43聚集體破壞核孔蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)因子功能。蛋白質(zhì)相互作用在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮著重要作用，但其中上游和下游蛋白或小分子僅與感興趣的蛋白質(zhì)之間是短暫相互作用，對(duì)研究信號(hào)通路造成了重大挑戰(zhàn)。COUZENS等[13]使用BioID探測(cè)Hippo通路中的相互作用物，Hippo信號(hào)通路控制細(xì)胞增殖和凋亡以決定器官大小。通過(guò)使用BioID繪制19種途徑蛋白的相互作用組，研究者為Hippo途徑生成了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并確定了許多推定的調(diào)節(jié)劑和激酶底物。后續(xù)不同的研究者通過(guò)鄰近標(biāo)記技術(shù)繪制了不同信號(hào)通路的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，比如 NF-κB[14]、Ras[15]、MAPK[16]等。APEX技術(shù)1 min的標(biāo)記時(shí)間框架可以被利用來(lái)捕捉動(dòng)態(tài)細(xì)胞過(guò)程中所涉及的蛋白質(zhì)相互作用組變化。PAEK等[17]用APEX技術(shù)探究激活劑激活后血管緊張素II 1型受體（AT1R）和β2-腎上腺素能受體（β2AR）的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，APEX還被用于探究激動(dòng)劑治療后δ-阿片受體相互作用組的變化。

2.2 蛋白質(zhì)與DNA相互作用

蛋白質(zhì)與DNA相互作用對(duì)于基因表達(dá)、基因組完整性和染色質(zhì)組織的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。ChIP-seq被廣泛用于捕獲和測(cè)序與誘餌蛋白質(zhì)相關(guān)的DNA區(qū)域。這種鄰近標(biāo)記技術(shù)適合運(yùn)用在活細(xì)胞中，并使用過(guò)氧化物酶APEX對(duì)靠近誘餌的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物素化，這些蛋白質(zhì)又通過(guò)甲醛交聯(lián)到相鄰的DNA區(qū)域。隨后，生物素化的蛋白質(zhì)-DNA片段復(fù)合物通過(guò)鏈霉親和素進(jìn)行富集，并通過(guò)下一代測(cè)序進(jìn)行分析。最近，ChromID被用于研究特定染色質(zhì)標(biāo)記處的蛋白質(zhì)相互作用組，該方法鑒定了在組蛋白H3 Lys4和Lys27[18]上三甲基化修飾的啟動(dòng)子區(qū)域。盡管酶的存在可能會(huì)影響與染色質(zhì)結(jié)合的相互作用蛋白，但這些研究提供了一種工具來(lái)研究染色質(zhì)功能的調(diào)節(jié)機(jī)制?；贏PEX的鄰近標(biāo)記技術(shù)也被用于繪制與線粒體DNA相關(guān)的蛋白質(zhì)圖譜，揭示了7種以前未知的線粒體類核相關(guān)蛋白[13]。

2.3 蛋白質(zhì)與RNA相互作用

蛋白質(zhì)和RNA之間的相互作用對(duì)于廣泛的細(xì)胞功能也是至關(guān)重要，目前鄰近標(biāo)記技術(shù)已與蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)相結(jié)合，以在特定亞細(xì)胞區(qū)域發(fā)現(xiàn)接近誘餌蛋白質(zhì)的RNA。APEX-RIP[19]使用甲醛，在細(xì)胞裂解前將APEX生物素化蛋白質(zhì)與RNA交聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)基于鏈霉親和素的蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物富集。APEX-RIP和Proximity-CLIP已應(yīng)用于研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核纖層和細(xì)胞表面[20]的RNA。FAZAL等[21]使用APEX-seq生成轉(zhuǎn)錄組范圍的人類成纖維細(xì)胞亞細(xì)胞RNA圖譜，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄本位置與基因組結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)定位之間的關(guān)聯(lián)。

3 總結(jié)

自從鄰近標(biāo)記技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，越來(lái)越多的研究者將其應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，比如植物、斑馬魚、蠕蟲等。本文介紹了目前使用的鄰近標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用，鄰近標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用的研究提供了很大幫助，鄰近標(biāo)記技術(shù)有著傳統(tǒng)方法不能相比的優(yōu)勢(shì)，它可以捕捉弱、瞬時(shí)的的蛋白質(zhì)相互作用，可以在空間和時(shí)間上監(jiān)測(cè)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。同時(shí)各種鄰近標(biāo)記酶的發(fā)現(xiàn)與優(yōu)化加速了細(xì)胞圖譜的繪制進(jìn)行，加速了對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的研究。隨著鄰近標(biāo)記技術(shù)的蓬勃發(fā)展，將為廣大的研究者提供新的思路，推動(dòng)一些重要生命科學(xué)問(wèn)題的解決，為發(fā)現(xiàn)一些疾病的發(fā)病機(jī)制提供新方法。