張旭旭，馬蘇美，2

（1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院超聲科，甘肅 蘭州 730000）

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤［1］，約占所有內(nèi)分泌腫瘤的95%。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid cancer，PTC）是最常見的甲狀腺癌類型，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)均在增長(zhǎng)［2］。主要是由于各種輔助診斷技術(shù)尤其是高頻超聲的臨床應(yīng)用，以及人們健康意識(shí)的提高使得PTC 檢出率明顯上升。借助超聲檢查的影像學(xué)征象可對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)進(jìn)行危險(xiǎn)分級(jí)，從而有利于臨床管理。隨著臨床對(duì)鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性需求的提高，僅僅通過(guò)分級(jí)管理不能很好地滿足臨床需求。細(xì)針穿刺（fine needle aspiration ，F(xiàn)NA）是術(shù)前鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的最常用工具。甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)Bethesda報(bào)告系統(tǒng)是配合FNA 的規(guī)范解讀［3］。由于細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的局限性，約1/3 的甲狀腺結(jié)節(jié)不能確定其良惡性［4］，因此需要借助其他方法輔助鑒別其良惡性。BRAF基因突變是PTC 中突變率較高的一種突變，通過(guò)BRAF 突變檢測(cè)聯(lián)合FNA 可提高PTC 的診斷率［5］。然而，BRAF基因突變預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值尚存在一定的爭(zhēng)議。本文就目前BRAF基因突變?cè)赑TC 中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 BRAF 基因突變的一般特征

BRAF突變是Davies 及其同事于2002 年在惡性黑色素瘤中首次被發(fā)現(xiàn)［6］，隨后在甲狀腺癌中也發(fā)現(xiàn)此突變并被廣泛研究。BRAF基因是原癌基因，該原癌基因編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶BRAF，屬于RAF 蛋白激酶家族的一種，是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)級(jí)聯(lián)的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)物，有助于將信號(hào)從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞核。這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路稱為MAPK 通路，對(duì)生長(zhǎng)和細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和凋亡具有重要意義［7］，是與人類腫瘤相關(guān)的最重要的致癌信號(hào)通路之一。BRAF V600E 突變是甲狀腺癌最常見的突變位點(diǎn)，其突變后導(dǎo)致所表達(dá)蛋白質(zhì)中第600 位的纈氨酸（V）轉(zhuǎn)換為谷氨酸（E）。BRAF V600E 突變與PTC 密切相關(guān)，其在甲狀腺癌中突變率差異較大。以往的研究表明，在甲狀腺癌中BRAFV600E的突變率從29%到83%不等［8］，與西方國(guó)家相比，亞洲國(guó)家似乎具有更高的突變率［9，10］，這可能與碘攝入量的差異［11］、人種等因素相關(guān)。

2 BRAF 基因突變的檢測(cè)方法

檢測(cè)BRAF 狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)是通過(guò)桑格測(cè)序或二代基因測(cè)序?qū)M織直接進(jìn)行突變檢測(cè)。雖然直接測(cè)序準(zhǔn)確、直觀，但是價(jià)格較高、操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不利于在臨床推廣。此外，還有基于BRAF基因表達(dá)蛋白產(chǎn)物的免疫組化法和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的（polymerase chain reaction，PCR）間接檢測(cè)方法。有研究納入72 例術(shù)后福爾馬林固定石蠟包埋的標(biāo)本，通過(guò)抗BRAFV600E 抗體的免疫組化方法和桑格測(cè)序評(píng)估突變狀態(tài)的價(jià)值表明，免疫組化法是種高敏感性、高特異性和準(zhǔn)確性的方法，在常規(guī)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室有較高的應(yīng)用價(jià)值［12］。不過(guò)，在術(shù)前FNA 穿刺標(biāo)本中，與基因測(cè)序的方法相比，在細(xì)胞涂片上直接應(yīng)用免疫組化的方法時(shí)有較高假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)［13］。Kim 等［14］通過(guò)實(shí)時(shí)PCR 的方式檢測(cè)BRAF 突變與二代測(cè)序相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)BRAF V600E 突變與二代基因測(cè)序有著相似的診斷敏感性和特異性，并且實(shí)時(shí)PCR 的檢測(cè)方法更為方便快捷，而且需要模板DNA 的濃度也較直接測(cè)序更低。因此，通過(guò)PCR 檢測(cè)BRAF V600E 突變對(duì)臨床具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

3 BRAF 基因突變與PTC 侵襲性的關(guān)系

由于甲狀腺癌的過(guò)度診治問(wèn)題日益突出，通過(guò)尋找有關(guān)侵襲性的危險(xiǎn)因素預(yù)測(cè)PTC 患者的預(yù)后仍在積極探索。找到一種或幾種生物標(biāo)志物來(lái)特異性識(shí)別惡性腫瘤對(duì)臨床具有十分重要的意義。在甲狀腺癌中，目前最有前途也最有爭(zhēng)議的生物標(biāo)志物之一是BRAFV600E 基因突變。 由于BRAFV600E 突變具有較高的特異性（99%）和較高的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值［15］，通過(guò)聯(lián)合評(píng)價(jià)甲狀腺結(jié)節(jié)BRAFV600E 突變狀態(tài)，有助于提高PTC 診斷率，減少不必要的診斷性手術(shù)［5，16］。然而，目前通過(guò)檢測(cè)BRAF V600E 基因突變鑒別PTC 侵襲性病理特征尚存在一定爭(zhēng)議。一些研究表明，BRAF V600E基因突變與PTC 的甲狀腺外侵犯病理特征、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)等相關(guān)［8，17-19］，是PTC 不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此外，Wang 等［20］在一項(xiàng)多中心回顧性研究中表明，在存在BRAF V600E 基因突變的患者中，男性是PTC 不良臨床預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。然而，這些發(fā)現(xiàn)卻沒能在不同國(guó)家的研究中被重復(fù)驗(yàn)證［21-23］。BRAF 突變確定與PTC 具有一定的相關(guān)性，但是據(jù)此說(shuō)明其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)等中有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值可能會(huì)存在一定誤差，根據(jù)BRAFV600E 突變狀態(tài)制定手術(shù)方法是否能夠改善臨床預(yù)后還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 BRAF 和TERT 基因突變共存與PTC 侵襲性的關(guān)系

由于單獨(dú)BRAF基因突變檢測(cè)可能存在的局限性，腫瘤的發(fā)生也是多基因參與的過(guò)程。因此，有研究希望聯(lián)合PTC 相關(guān)的其他突變，共同預(yù)測(cè)PTC 患者的預(yù)后。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase ，TERT）啟動(dòng)子突變與甲狀腺癌的相關(guān)性已被證實(shí)［24］。TERT 是端粒酶的催化蛋白亞基，它有著維持染色體的完整性和基因組穩(wěn)定性的功能［25］。端粒酶在生殖細(xì)胞和干細(xì)胞中有較好表達(dá)，而在體細(xì)胞中被抑制。當(dāng)發(fā)生TERT突變時(shí)，可使細(xì)胞獲得無(wú)限增殖的潛力而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生［26］。Lee 等［27］的研究結(jié)果表明與TERT 啟動(dòng)子和BRAF V600E 兩種突變均為陰性的組相比，兩種突變同時(shí)存在的情況與老年和更晚的腫瘤分期顯著相 關(guān)。Trybek 等［28］通 過(guò) 對(duì)568 名PTC 患 者 的 嚴(yán) 格監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)BRAFV600E 和TERT突變共存的PTC 患者與較差的預(yù)后和臨床病程相關(guān)，并且可能有助于預(yù)測(cè)較差的治療反應(yīng)、復(fù)發(fā)和較差的預(yù)后。因此，BRAFV600E 和TERT 啟動(dòng)子突變可以增強(qiáng)PTC 侵襲性的作用機(jī)制被研究。其中一種猜想是與BRAF 突變誘導(dǎo)上調(diào)幾種ETS 轉(zhuǎn)錄因子，TERT啟動(dòng)子突變可能通過(guò)創(chuàng)建ETS 結(jié)合位點(diǎn)并增加TERT 表達(dá)啟動(dòng)癌變有關(guān)。BRAF V600E 突變激活的分子通路通過(guò)TERT 啟動(dòng)子突變或TERT 表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。通過(guò)這種兩種突變同時(shí)存在的協(xié)同作用增強(qiáng)了癌結(jié)節(jié)的侵襲性［29］。還有一種猜想是BRAF V600E/MAP 激酶通路磷酸化并激活FOS，F(xiàn)OS 作為轉(zhuǎn)錄因子與GABPB 啟動(dòng)子結(jié)合使GABPB 表達(dá)增加，驅(qū)動(dòng)GABPA-GABPB 復(fù)合物形成，后者選擇性結(jié)合并激活突變TERT 啟動(dòng)子，上調(diào)TERT 表達(dá)。升高的TERT 作為一種腫瘤蛋白，有力地促進(jìn)了癌細(xì)胞的侵襲行為和腫瘤的發(fā)展［30］。兩種猜想均與協(xié)同作用相關(guān)，最終導(dǎo)致TERT 表達(dá)增加。就目前研究現(xiàn)狀分析，同時(shí)檢測(cè)到BRAF V600E 和TERT 啟動(dòng)子突變預(yù)示著較差的臨床預(yù)后，有助于更好地對(duì)甲狀腺癌患者進(jìn)行治療。除TERT 啟動(dòng)子突變外，BRAF 突變聯(lián)合PIK3CA 突變、TP53突變、AKT1 突變亦與PTC 的侵襲性行為相 關(guān)［15，31］。Colombo 等［32］通 過(guò) 對(duì)208 例PTC 患 者 同時(shí)檢測(cè)19 種常見的基因改變，通過(guò)基因組背景分析表明，精確地進(jìn)行甲狀腺結(jié)節(jié)的危險(xiǎn)分層不能依賴單一基因的改變，突變密度和遺傳異質(zhì)性對(duì)臨床特征和疾病結(jié)果也有著很大影響。Lee 等［33］通過(guò)選定的高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)PTC 患者進(jìn)行多種基因檢測(cè)，同樣發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者有一個(gè)以上的遺傳變異。

然而，來(lái)自日本庫(kù)瑪醫(yī)院的數(shù)據(jù)顯示，因PTMC 發(fā)生進(jìn)展而放棄主動(dòng)監(jiān)測(cè)病例轉(zhuǎn)化手術(shù)的病例中，BRAF基因突變?cè)诜€(wěn)定疾病組（61%）、腫瘤增大組（70%）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（80%）之間沒有顯著差異。這些出現(xiàn)進(jìn)展的病例中沒有1 例呈TERT 啟動(dòng)子基因突變陽(yáng)性［34］。似乎出現(xiàn)進(jìn)展的PTMC 并不會(huì)同時(shí)存在BRAF突變和TERT突變。不過(guò)這可以用最新提出的自限性癌癥的概念解釋。自限性癌癥是日本教授基于以下3 點(diǎn)而提出的甲狀腺癌自然史的概念［35］，并且認(rèn)為自限性癌癥是真正惡性的，但不會(huì)發(fā)展為致死的癌癥。第一，多項(xiàng)研究表明預(yù)防性切除PTMC 不會(huì)改變死亡率。第二，因PTMC 也具有增殖和轉(zhuǎn)移的能力，但不會(huì)因此而發(fā)展成為致死性癌癥。第三，乳頭狀癌在年輕人中的高發(fā)病率提示甲狀腺癌的最初發(fā)病可能發(fā)生在嬰兒期。根據(jù)自限性癌癥的概念，這些出現(xiàn)進(jìn)展的病例可能還是自限性甲狀腺癌，而不是致死性的甲狀腺癌。目前研究認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是多因素作用，多基因參與并經(jīng)多階段發(fā)展共同作用的結(jié)果，而基因的表達(dá)亦是表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間相互作用的過(guò)程。而BRAF 和TERT 基因突變共存可能是發(fā)展為致死性甲狀腺癌的一個(gè)開關(guān)。目前研究之所以對(duì)BRAFV600E 評(píng)價(jià)PTC 患者預(yù)后的價(jià)值存在爭(zhēng)議，可能與除BRAFV600E 之外的基因變異未被檢測(cè)有關(guān)。再者，BRAF 在PTC 中的突變率約為29%～83%［8］，而PTC 術(shù)后的患者20 年生存率可達(dá)99%［36］。這種差異也證明單獨(dú)BRAF 基因突變不太可能是預(yù)測(cè)PTC 不良預(yù)后的預(yù)測(cè)因素。因此，僅通過(guò)BRAF 一種基因突變來(lái)預(yù)測(cè)PTC 具有侵襲性特征并不可靠。

綜上所述，甲狀腺結(jié)節(jié)的BRAF 突變基因檢測(cè)可用于輔助提升甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的診斷。然而，BRAF V600E 突變?cè)谠u(píng)價(jià)PTC 侵襲性的價(jià)值上尚有一定爭(zhēng)議，這可能與潛在的基因變異未被檢測(cè)有關(guān)。因此，為了降低過(guò)度診治對(duì)患者的不利影響，和推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療和個(gè)體化治療的發(fā)展，未來(lái)還需要更深入的研究，使患者更多地受益。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

張旭旭：課題實(shí)驗(yàn)研究的執(zhí)行人，收集課題病例資料，完成數(shù)據(jù)分析及論文初稿的寫作；馬蘇美：項(xiàng)目的構(gòu)思者及負(fù)責(zé)人，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析、論文寫作與修改。兩位作者都閱讀并同意最終的文本。