全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

劉卓航 綜述，董少忠 審校

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118；2.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500

自1995年科學(xué)家首次在酵母細(xì)胞中獲得第1個(gè)轉(zhuǎn)錄組，并提出轉(zhuǎn)錄組這個(gè)概念［1］，到現(xiàn)在的后基因組學(xué)時(shí)代，轉(zhuǎn)錄組作為連接基因組和蛋白質(zhì)組遺傳信息與生物功能的必然紐帶，在生物領(lǐng)域獲得了持續(xù)廣泛的關(guān)注［2］。全轉(zhuǎn)錄組有2 種不同的定義：一種指全部mRNA 的集合，另一種指某個(gè)物種或特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下產(chǎn)生的所有RNA 的總和，包括各類編碼RNA 和各類非編碼RNA（non-coding RNA）［3］。不僅是在生物學(xué)方面，在其他領(lǐng)域尤其是臨床醫(yī)學(xué)方面，全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)也具有重要作用。本文對(duì)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在探索一些復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制和診斷標(biāo)志物方面應(yīng)用的最新進(jìn)展作一綜述。

1 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)

全轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究與測(cè)序平臺(tái)的變革密切相關(guān)。近年來，測(cè)序平臺(tái)的每一次變革均對(duì)全轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究模式產(chǎn)生了深刻的影響，發(fā)揮了巨大的推動(dòng)作用［4］。

1.1 第一代測(cè)序技術(shù)平臺(tái) 20 世紀(jì)70年代末，SANGER 等［5］發(fā)明了雙脫氧終止法，實(shí)現(xiàn)了對(duì) DNA序列的測(cè)序與分析，以此為標(biāo)志的第一代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，極大地促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。但由于Sanger測(cè)序本身存在的基因定量偏差，通量較低和自動(dòng)化相對(duì)較差等問題，逐漸被淘汰。

1.2 第二代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）平臺(tái) 隨著研究者對(duì)測(cè)序技術(shù)的不斷改良和革新，NGS 出現(xiàn)。與第一代測(cè)序技術(shù)相比，NGS 具有精確度和靈敏度更高，覆蓋度更均勻，轉(zhuǎn)錄信息更豐富，數(shù)據(jù)質(zhì)量更高，成本更低等優(yōu)勢(shì)，成為近年來轉(zhuǎn)錄組方面研究的主要方法。目前，全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的平臺(tái)有很多，其中主要有羅氏公司的454、美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司公司的SOLiD 和米魯納公司的Solexa三大平臺(tái)［6］。在過去10年間，Illumina 公司的Solexa技術(shù)，即邊合成邊測(cè)序（seq-uencing by synthesis，SBS）技術(shù)發(fā)展迅速，其中HiSeq 系列的測(cè)序平臺(tái)成為NGS中應(yīng)用最廣泛的平臺(tái)［7］。

1.3 第三代測(cè)序技術(shù)平臺(tái) 最近幾年逐漸興起的第三代測(cè)序技術(shù)（next-next generation sequencing）又稱為單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)，以Pacific Biosciences（Pac-Bio）公司的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（single molecule real time sequencing，SMRT）［8］和 Oxford Nanopore Technologies 公司的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)為代表［9］。其具有比NGS 更大的通量和更高的效率，且不需經(jīng)過橋式擴(kuò)增。

2 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的原理和基本步驟

全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是指運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)將生物體在某一特定狀態(tài)下的編碼和非編碼RNA 的序列測(cè)定出來，以獲得研究樣本幾乎所有的轉(zhuǎn)錄組［3］。

首先對(duì)目標(biāo)樣品的總RNA 進(jìn)行提取，再根據(jù)需求進(jìn)行樣品處理，根據(jù)所選用的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)的要求將所需的RNA 片段化，構(gòu)建測(cè)序文件，進(jìn)行橋式PCR 擴(kuò)增，達(dá)到一定的豐度上機(jī)測(cè)序，以獲得需要的序列，再將所得到的序列與參考基因比對(duì)，形成全基因組范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)錄譜，進(jìn)行生物信息分析［10］。

3 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在臨床上的應(yīng)用

全轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的發(fā)展帶來的變革不僅僅是在生物學(xué)方面，還體現(xiàn)在在臨床醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

3.1 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在疾病診斷標(biāo)志物研究中的應(yīng)用 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在針對(duì)一些復(fù)雜疾病的診斷標(biāo)志物的檢測(cè)方面提供了更加豐富可靠的檢測(cè)手段。有研究者運(yùn)用RNA-seq 技術(shù)對(duì)擴(kuò)張型心肌?。╠ilated cardiomyopathy，DCM）和限制性心肌?。╮estrictive cardiomyopathy，RCM）患者進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，揭示了心衰患者蛋白編碼和lncRNA 的一種特殊表達(dá)模式，證實(shí)了患者的左室心肌生物標(biāo)記物可通過基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的方法可靠地識(shí)別，提供了對(duì)心力衰竭患者的心衰標(biāo)志物更可靠的檢出手段［11］。尤其是面對(duì)一些現(xiàn)有醫(yī)學(xué)手段難以解決的疾病，如精神分裂癥（schizophrenia，SCZ）。這類重度精神類疾病缺乏特異的診斷標(biāo)志物，在臨床上一般只能以患者癥狀作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，常規(guī)檢測(cè)手段的缺陷常導(dǎo)致診斷困難。而全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的運(yùn)用很好地改善了該問題，如有研究者使用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)SCZ 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的circRNAs表達(dá)譜進(jìn)行測(cè)序，差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了新的SCZ 分子診斷標(biāo)志物，為診斷SCZ 提供了更加可靠的臨床依據(jù)［12］。

全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序同樣也為一些復(fù)雜疾病的診斷提供了新的潛在診斷標(biāo)志物。如庫(kù)欣病，有研究通過全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)垂體ACTH 腺瘤全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在轉(zhuǎn)錄組水平篩選相關(guān)差異表達(dá)基因和microRNA，并與患者臨床表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為篩選庫(kù)欣病診斷標(biāo)志物提供了可能的依據(jù)［13］。有研究表明，運(yùn)用RNA-seq 技術(shù)對(duì)3 對(duì)結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）和匹配的正常黏膜（normal mucosa，NM）進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組分析，分析差異基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了可能用于鑒定直腸癌的新的生物標(biāo)志物［14］。

3.2 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在疾病分子機(jī)制研究中的應(yīng)用 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序同樣為復(fù)雜疾病的分子機(jī)制研究提供了新的技術(shù)和方向，也為臨床上更好地防控和治療這些疾病提供了新的思路和策略。

有研究顯示，全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠用于分析2 型糖尿病和冠心病患者的心外膜組織脂肪（epicardial adipose tissue，EAT），通過鑒定分析差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)高血糖引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能與患者EAT變化有關(guān)，為糖尿病患者中引起動(dòng)脈粥樣硬化的新途徑提供了依據(jù)［15］。

全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)同樣也在疾病的臨床治療策略上提供了新的思路。如狂犬病，有研究者提取了狂犬病病毒CVS11 感染小鼠的腦細(xì)胞，并進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析，檢測(cè)到大量差異基因表達(dá)和lncRNA變化，為狂犬病病毒感染機(jī)體免疫反應(yīng)和免疫應(yīng)答的探索提供了參考，也為開發(fā)新的狂犬病有效治療藥物或疫苗提供了新的策略與方向［16］。有研究者使用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)比較了人類CD4+T 細(xì)胞與Nef-deleted（Δ-Nef）NL4-3 病毒，分析差異基因表達(dá)，表明在HIV-1 中Nef 蛋白的作用下，干擾素反應(yīng)、IL-15 和JAK ／ STAT 信號(hào)通路以及參與細(xì)胞代謝、凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控和核糖體生物發(fā)生的基因均發(fā)生改變，這些改變可能在啟動(dòng)宿主細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活化和病毒復(fù)制方面發(fā)揮作用［17］。另外，將全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)運(yùn)用于各類動(dòng)物模型和人類的肌肉組織，發(fā)現(xiàn)了骨組織中新的細(xì)胞類型，以及可能導(dǎo)致骨髓炎和骨質(zhì)疏松等骨骼疾病的新基因和新轉(zhuǎn)錄因子［18］。

在如何有效防控和治療惡性腫瘤這類問題時(shí)，全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也提供了新的方向和解決策略。運(yùn)用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可檢測(cè)出一些傳統(tǒng)手段難以檢測(cè)出的腫瘤驅(qū)動(dòng)因素，如拼接變異和基因組變化等。有研究者運(yùn)用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)多例多形性腺瘤（pleomorphic adenoma，PA）患者的配對(duì)腫瘤與瘤旁唾液腺腺體，篩選兩組間差異基因，分析預(yù)測(cè)差異基因所編碼蛋白間的相互作用，挖掘這些差異基因在腫瘤形成過程中的作用及通路［19］。還有研究者對(duì)患者的癌組織和正常組織進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)142 個(gè)差異表達(dá)基因，這些差異表達(dá)基因與腫瘤的增殖、遷移、黏附、血管生成及凋亡等生物學(xué)行為密切相關(guān)［20］。另外，還可通過全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)識(shí)別導(dǎo)致腫瘤形成及對(duì)治療產(chǎn)生抵抗的相關(guān)靶基因，對(duì)進(jìn)一步指導(dǎo)其臨床治療和診斷具有重要的理論及實(shí)踐意義［21］。在一些研究中，研究者運(yùn)用全轉(zhuǎn)錄測(cè)序技術(shù)分析與結(jié)腸癌相關(guān)的lncRNA，分析其中差異基因的表達(dá)，并闡明這些相關(guān)基因可能與腫瘤生成有關(guān)［22］。另外，全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)還能篩選潛在的抗原表位和治療靶點(diǎn)。有研究者聯(lián)合全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）和質(zhì)譜分析（mass spectrometric，MS）兩種技術(shù)分析基因和蛋白的差異表達(dá)情況，通過HLA I 等位基因檢測(cè)結(jié)合RNA-seq 的基因變異、融合基因結(jié)果預(yù)測(cè)，并篩選潛在的腫瘤新抗原或抗原表位，為了解甲狀腺癌的生物學(xué)行為和免疫因素在甲狀腺癌診治中的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)［23］。

隨著全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在研究疾病分子機(jī)制領(lǐng)域的逐漸深入，其必然成為防控和治療多種復(fù)雜疾病的新技術(shù)。

3.3 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用 在臨床檢驗(yàn)學(xué)領(lǐng)域，全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展同樣帶來了變革。傳統(tǒng)的病原微生物鑒定技術(shù)主要分為2類：基于細(xì)胞培養(yǎng)的方法（如形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞生理生化特征、細(xì)菌培養(yǎng)分型、基因芯片、自動(dòng)化微生物分析系統(tǒng)等）和基于特異引物 ／ 探針 ／ 抗體的方法（如抗原抗體反應(yīng)）［24］。但這些傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法均存在不足，尤其是在面對(duì)未知和突變病原體時(shí)。而通過運(yùn)用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建基于高通量測(cè)序技術(shù)的病原體檢測(cè)系統(tǒng)，則為病原微生物的檢測(cè)提供了新的更加方便、快速的手段，尤其是對(duì)于常規(guī)手段不易檢出的病原物。如2019年底暴發(fā)的新發(fā)肺炎疫情，經(jīng)鑒定病原體為一種新型冠狀病毒［25］。此次疫情的暴發(fā)給傳統(tǒng)的病原體檢測(cè)帶來巨大挑戰(zhàn)，如何快速地從患者體內(nèi)鑒定出冠狀病毒顯得非常重要。有研究者利用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)快速檢測(cè)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中的冠狀病毒核酸序列，能夠靈敏、快速地從高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中檢測(cè)出冠狀病毒序列，具有很好的泛化能力，可對(duì)新發(fā)和高變異株冠狀病毒序列進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)［26］。

4 展 望

全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)作為后基因組時(shí)代的產(chǎn)物，還可與其他組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，形成新的探究復(fù)雜疾病的系統(tǒng)方法。盡管目前全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)尚存在一些問題，但隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展成熟，以及應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域，其必將會(huì)成為生物學(xué)研究的有效手段，也會(huì)給臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來一場(chǎng)技術(shù)革新。