楊雨濤，李欣然，謝嘉欣，王 袁，馬聞擎，付霞霏

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510280

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指女性在40歲前出現(xiàn)卵巢功能衰退的臨床綜合征，以月經(jīng)紊亂（如停經(jīng)或月經(jīng)稀發(fā)至少4個(gè)月）伴高促性腺激素和低雌激素為特征，且間隔＞4周連續(xù)2次卵泡刺激素（folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH）＞25 IU/mL［1］。POI病因復(fù)雜，包括遺傳因素、自身免疫失調(diào)、感染或醫(yī)源性因素等。自身免疫失調(diào)可能參與4%～30%的POI發(fā)生。POI與其他自身免疫病密切相關(guān)，如艾迪生病、抗磷脂抗體綜合征、甲狀腺功能減退癥和糖尿病等［2-3］。

miRNA是長(zhǎng)約22 nt的非編碼RNA。這些miRNA能夠與mRNA結(jié)合，阻斷蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)，防止它們翻譯成為蛋白質(zhì)，在細(xì)胞增殖、代謝、凋亡、分化等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。miRNA-21是一種多功能miRNA，可調(diào)節(jié)炎癥，在先天性和獲得性免疫反應(yīng)、生殖系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病及多種腫瘤中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［4］。前期研究表明，過(guò)表達(dá)miRNA-21與減少顆粒細(xì)胞凋亡有關(guān)，并部分緩解了化學(xué)治療引起的卵巢損害（卵泡計(jì)數(shù)、卵巢質(zhì)量和雌二醇水平增加，F(xiàn)SH水平降低）［5］，但尚未闡明miRNA-21與自身免疫性POI的相關(guān)性。

通常一種miRNA可以和多個(gè)靶基因相互作用。miRNA-21能靶向Pellino-1（Peli1）基因，促進(jìn)致病性輔助性T細(xì)胞17的葡萄糖代謝［6］。miRNA-21的一些靶基因如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3與癌癥有密切關(guān)系［7］。Peli1基因編碼的蛋白質(zhì)是一種高度保守的環(huán)指類E3泛素化連接酶，在T細(xì)胞中多處表達(dá)，并負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化［8］。目前，普遍認(rèn)為自身免疫性POI的發(fā)病機(jī)制是T細(xì)胞比例失衡，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）比例下降［9］。研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Peli1可以改善自身耐受性和免疫抑制，并發(fā)現(xiàn)Peli1與多種自身免疫病有關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性腦脊髓炎［10-11］。因此，miRNA-21可能通過(guò)調(diào)控Peli1參與自身免疫性POI的發(fā)生和發(fā)展。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miRNA-21的靶基因，并分析miRNA-21和其靶基因Peli1在自身免疫性POI模型小鼠中的表達(dá)，為探討自身免疫性POI的發(fā)病機(jī)制和治療策略提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及分組 7～8周齡雌性BALB/c小鼠（體重為18～22 g，動(dòng)物合格證號(hào)44005800010117）購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2018-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（粵）2019-0215］。所有小鼠均在（30±2）℃和14 h光照/10 h黑暗條件下自由攝食、飲水，每天早上8：00-9：00進(jìn)行陰道涂片檢查。選用發(fā)情周期正常的24只小鼠隨機(jī)均分為POI組和對(duì)照組，每組12只。本研究通過(guò)南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批（2018A030313167）。

1.2 POI模型小鼠構(gòu)建 小鼠透明帶3（zona pellucida 3，ZP3）多 肽（NSSSSQFIHGPR，中 國(guó)捷威生物科技有限公司）以1 mg/mL的質(zhì)量濃度溶解于蒸餾水中，超濾除菌。然后將ZP3多肽溶液乳化成等體積的完全免疫佐劑和不完全免疫佐劑。POI組小鼠在后足和腹部皮下注射0.15 mL含75 μg ZP3多肽的完全免疫佐劑乳劑，14 d后在相同部位皮下注射0.15 mL含75 μg ZP3多肽的不完全免疫佐劑乳劑。自第2次注射后6周，小鼠出現(xiàn)發(fā)情周期不規(guī)則或延長(zhǎng)，證明POI模型小鼠建立成功。對(duì)照組小鼠在相同部位注射等體積生理鹽水。

1.3 卵巢結(jié)構(gòu)和卵泡計(jì)數(shù) 第2次注射后6周 （POI小鼠建模成功）隨機(jī)選取POI及對(duì)照組小鼠各6只，取單側(cè)卵巢，用4%多聚甲醛溶液固定后進(jìn)行石蠟包埋、切片（厚度為5 μm），然后進(jìn)行H-E染色。在光鏡下通過(guò)盲法觀察自身免疫性卵巢炎程度并進(jìn)行各級(jí)卵泡（原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、成熟卵泡）計(jì)數(shù)。

1.4 卵巢功能檢測(cè) 第2次注射后2～6周，每天用細(xì)尖吸管收集小鼠陰道分泌物進(jìn)行陰道涂片，通過(guò)亞甲藍(lán)染色在相差顯微鏡下觀察小鼠的發(fā)情周期。POI組和對(duì)照組各6只小鼠從眼球取外周血后，在4 ℃下以1 509×g離心10 min，分離血清。通過(guò)ELISA檢測(cè)試劑盒（瑞士Roche公司）檢測(cè)血清抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）水平，采用放射免疫試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所）檢測(cè)血清FSH水平，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)（德國(guó)Bayer公司）檢測(cè)血清雌二醇水平。上述檢測(cè)委托南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。

1.5 炎癥因子測(cè)定 取POI及對(duì)照組剩余的各6只小鼠，取一側(cè)卵巢在無(wú)菌條件下制成勻漿，用ELISA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Life Technologies公司）檢測(cè)卵巢組織中炎癥因子γ-干擾素和IL-10水平。

1.6 脾臟Treg比例測(cè)定及分選 用含2% FBS的Hanks平衡鹽溶液使脾臟破碎，通過(guò)篩網(wǎng)去除組織碎片，加入紅細(xì)胞裂解液混勻后靜置5 min，1 000×g離心5 min，棄上清，用PBS洗滌2次，再懸浮。細(xì)胞與熒光標(biāo)記的抗小鼠CD4、CD25抗體及同型對(duì)照的小鼠IgG2a抗體（美國(guó)eBioscience公司）偶聯(lián)30 min，用Fix&Cell Fix&Perm細(xì)胞固定透化試劑盒（美國(guó)Life Technologies公司）固定透化。然后用Fc受體阻斷劑封閉細(xì)胞，再使用抗小鼠轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白3抗體進(jìn)行染色。最后用PBS洗滌2次，再懸浮后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。將脾細(xì)胞懸液在4 ℃、168×g離心10 min，棄上清，取細(xì)胞沉淀懸浮于含2% FBS和1 mmol/L EDTA的PBS中。用EasySepTM小鼠CD4＋CD25＋Treg分離試劑盒Ⅱ（加拿大Stemcell Technologies公司）從脾細(xì)胞懸液中分離CD4＋CD25＋Treg。

1.7 外周血和卵巢組織miRNA-21的檢測(cè) 取兩組各12只小鼠的外周血，用紅細(xì)胞裂解液（加拿大Cedarlane公司）去除紅細(xì)胞，在室溫下以241×g離心10 min，沉淀物用PBS洗滌2次，得到外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)染液染PBMC，在明場(chǎng)顯微鏡（德國(guó)ZEISS公司）下觀察PBMC活性 并 計(jì) 數(shù)。用TRIzol試 劑（美 國(guó)Invitrogen公司）分別提取小鼠PBMC和兩組各12只小鼠另一側(cè)卵巢組織的總RNA。引物由廣州燁善生物科技有限公司合成。在ABI PRISM?7500型PCR檢測(cè)系統(tǒng)上使用特異性引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，PCR反 應(yīng) 條 件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃32 s循 環(huán)40次。用 公 式2-ΔΔCt計(jì) 算Peli1mRNA相對(duì)表達(dá)量。小鼠PBMC中目的基因的檢測(cè)以Cel-miRNA-39模擬物作為內(nèi)參照，miRNA-21上游引物序列為5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA-3'，下游引物序列為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACATC-3'；Cel-miRNA-39模擬物上游引物序列為5'-GACTTCATCACCGGGTGTAAATC-3'，下游引物序列為5'-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTGAC-3'。小鼠卵巢組織中目的基因的檢測(cè)以U6作為內(nèi)參照，miRNA-21上游引物序列為5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGATG-3'，下游引物序列為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；U6上游引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.8 生物信息學(xué)分析 通過(guò)TargetScan 5.1（http://www.targetscan.org/）、miRecords（http://c1.accurascience.com/miRecords/）、mirDIP（http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/）和miRanda（http://www.microrna.org/microrna/home.do）數(shù) 據(jù) 庫(kù) 篩 選 出miRNA-21的靶基因。對(duì)4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中共有的基因進(jìn)一步通過(guò)查閱文獻(xiàn)篩選。

1.9 外周血及脾臟Treg中Peli1的檢測(cè) 采用TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）分別提取小鼠PBMC和CD4＋CD25＋Treg的總RNA。以GAPDH作為內(nèi)參照進(jìn)行qPCR，反應(yīng)條件和相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算方法如1.7節(jié)所述。Peli1上游引物序列為5'-TGGTCCCTATGTCCCTCTGT-3'，下游引物序列 為5'-TGCGTACCATGAGGAAGTG-3'；GAPDH上游引物序列為5'-GGCCTCCAAGGAGTAAGAAA-3'，下游引物序列為5'-GCCCCTCCTGTTATTATGG-3'。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布且方差齊，以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般狀態(tài) 建模成功后，POI組小鼠表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲鈍、毛發(fā)光澤減弱、攝食量減少等抑郁樣行為，抓取時(shí)反抗不強(qiáng)烈；對(duì)照組小鼠仍保持行為活躍、攝食量正常，抓取時(shí)反抗強(qiáng)烈。

2.2 卵泡結(jié)構(gòu)及卵泡計(jì)數(shù) 卵巢組織經(jīng)H-E染色后在顯微鏡下觀察到，POI組卵泡數(shù)量明顯減少，未見(jiàn)成熟卵泡，黃體數(shù)量減少，卵巢間質(zhì)成分增多；對(duì)照組小鼠卵巢結(jié)構(gòu)規(guī)則，成熟卵泡和生長(zhǎng)中卵泡數(shù)量較多，各級(jí)卵泡形態(tài)及數(shù)量正常，發(fā)育良好，可見(jiàn)黃體形成（圖1）。POI組小鼠卵巢中原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和成熟卵泡的數(shù)量分別為2.67±1.37、1.25±0.62、1.42±0.90和0.83±0.72，分別少于對(duì)照組相應(yīng)各級(jí)卵泡的數(shù)量（分別為5.58±1.44、2.75±0.97、3.92±1.00和2.58±1.00），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

圖1 小鼠卵巢蘇木精-伊紅染色光鏡下觀察結(jié)果

2.3 發(fā)情周期 第2次注射后4周，POI組6只小鼠發(fā)情期減少，陰道涂片結(jié)果提示無(wú)核角化上皮細(xì)胞減少，與有核上皮、白細(xì)胞并見(jiàn)。第2次注射后5周，POI組10只小鼠出現(xiàn)發(fā)情周期紊亂，發(fā)情間期延長(zhǎng)。第2次注射后6周，POI組小鼠基本無(wú)發(fā)情期，僅為發(fā)情間期，陰道涂片結(jié)果提示偶爾見(jiàn)少量核上皮細(xì)胞，幾乎全是白細(xì)胞。觀察期間對(duì)照組小鼠發(fā)情周期均正常。

2.4 激素水平 POI組小鼠血清雌二醇、AMH水 平 均 低 于 對(duì) 照 組［（30.97±3.51）pg/mL vs（44.09±4.87）pg/mL、（4.17±0.52）ng/mL vs（7.87±0.91）ng/mL，P均＜0.01］，而POI組 小鼠血清FSH水平高于對(duì)照組［（4.59±0.81）IU/L vs（1.94±0.32）IU/L，P＜0.01］。

2.5 炎癥因子水平 POI組小鼠血清γ-干擾素水平高于對(duì)照組［（4.17±0.40）pg/mL vs（2.82±0.37）pg/mL，P＜0.01］，而血清IL-10水平低于對(duì)照組［（0.96±0.10）pg/mL vs（1.70±0.38）pg/mL，P＜0.01］。

2.6 脾 臟Treg比 例 POI組 小 鼠 脾 臟Treg的 比例 為（4.82±0.58）%，低 于 對(duì) 照 組［（10.91±1.12）%，P＜0.01］。

2.7 miRNA-21表 達(dá) 在 小 鼠PBMC中，POI組miRNA-21表達(dá)水平為0.63±0.09，低于對(duì)照組（0.99±0.03，P＜0.01）。在小鼠卵巢組織中，POI組miRNA-21表達(dá)水平為0.54±0.06，也低于對(duì)照組（1.55±0.18，P＜0.05）。

2.8 miRNA-21生物信息學(xué)分析 用TargetScan 5.1、miRecords、mirDIP和miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)分別篩選出382、25 422、3 345和3 561個(gè)miRNA-21靶基因，其中4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共同篩選出的miRNA-21靶基因有244個(gè)。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)Peli1對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行泛素化修飾參與多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，包括程序性死亡、自噬的發(fā)生與調(diào)控，故確定Peli1為進(jìn)一步研究的目標(biāo)基因。

2.9Peli1mRNA表達(dá) 在小鼠PBMC中，POI組Peli1的mRNA表達(dá)水平為0.12±0.12，低于對(duì)照組（1.47±0.32，P＜0.01）。在小鼠脾臟Treg中，POI組Peli1的mRNA表達(dá)水平為0.27±0.23，也低于對(duì)照組（1.19±0.35，P＜0.05）。

3 討 論

自身免疫性POI的發(fā)病率逐年上升，但其發(fā)病機(jī)制仍不明確，需進(jìn)一步研究。POI研究進(jìn)展較緩慢的一個(gè)重要原因是自身免疫性POI模型小鼠的構(gòu)建方法沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。有研究者用ZP3多肽成功構(gòu)建自身免疫性POI模型并使用該模型進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)［12-13］。本研究通過(guò)ZP3多肽二次免疫構(gòu)建POI模型小鼠，發(fā)現(xiàn)POI組小鼠的發(fā)情周期、卵巢結(jié)構(gòu)、激素和炎癥因子水平與對(duì)照組相比均發(fā)生改變，證明建模成功。

Treg是一類調(diào)控機(jī)體免疫功能的細(xì)胞群，以表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白3、CD25、CD4為表型特征，能維持免疫系統(tǒng)對(duì)自身成分的耐受，使機(jī)體保持免疫穩(wěn)態(tài)，在感染、腫瘤、免疫相關(guān)性疾病等方面具有抑制各種生理病理免疫應(yīng)答的作用。Kobayashi等［9］研究發(fā)現(xiàn)，POI患者CD4＋CD69＋T細(xì)胞的數(shù)量增加，而Treg減少。本研究通過(guò)構(gòu)建自身免疫性POI模型小鼠并測(cè)定Treg比例發(fā)現(xiàn)，POI組的Treg比例與對(duì)照組相比下降，說(shuō)明Treg在自身免疫性POI中具有調(diào)節(jié)免疫、維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的作用。

miRNA是一種在物種間高度保守的非編碼小RNA，在代謝性疾病、癌癥等中起關(guān)鍵作用。miRNA-21是最早鑒定出的哺乳動(dòng)物miRNA之一，在免疫應(yīng)答和炎癥性疾病中起重要作用。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，miRNA-21表達(dá)上調(diào)且可使淋巴細(xì)胞的數(shù)量減少［14］。miRNA-21也與子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜癌等婦科疾病相關(guān)［15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)在自身免疫性POI模型小鼠中，外周血和卵巢組織中miRNA-21表達(dá)均下降，說(shuō)明miRNA-21可能參與自身免疫性POI的發(fā)生和發(fā)展。

Peli1是一種泛素連接酶，與多種自身免疫病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，其基因位于染色體2p13.3，長(zhǎng)度為3 780 bp。在小鼠淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)組織中，外來(lái)抗原激活T細(xì)胞膜上的T細(xì)胞受體，進(jìn)一步刺激協(xié)同信號(hào)分子CD28，誘導(dǎo)Peli1表達(dá)增加［17］。針對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的研究發(fā)現(xiàn)，Peli1調(diào)節(jié)Treg的活性，使濾泡性輔助性T細(xì)胞減少和Treg增加，并且Peli1mRNA水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)指數(shù)呈負(fù)相關(guān)［18-19］。小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)多發(fā)性硬化及動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)病至關(guān)重要。Xiao等［11］的研究結(jié)果表明，Peli1在小膠質(zhì)細(xì)胞中大量表達(dá)，并在自身免疫性腦脊髓炎誘導(dǎo)過(guò)程中促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞趨化因子和促炎細(xì)胞因子的合成，從而促使T細(xì)胞募集到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本研究通過(guò)4個(gè)預(yù)測(cè)miRNA靶基因的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)測(cè)并分析相關(guān)文獻(xiàn)，篩選出Peli1基因，驗(yàn)證結(jié)果顯示自身免疫性POI小鼠PBMC和脾臟Treg中Peli1的mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組，初步證明了Peli1參與自身免疫性POI的發(fā)生和發(fā)展。

目前，miRNA-21與靶基因Peli1的關(guān)系和結(jié)合位點(diǎn)及Peli1如何調(diào)節(jié)Treg的比例和功能，從而參與自身免疫性POI發(fā)生和發(fā)展的具體機(jī)制尚未完全明確。miRNA-21與靶基因Peli1的關(guān)系及結(jié)合位點(diǎn)可通過(guò)雙螢光素酶報(bào)告基因等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。作為E3泛素化連接酶，Peli1能夠介導(dǎo)靶蛋白泛素化，而泛素化是調(diào)節(jié)Treg活化的重要機(jī)制［20］。Peli1參與K48和K63泛素鏈的形成，在T細(xì)胞的增殖、活化中發(fā)揮作用。Peli1通過(guò)泛素化負(fù)性調(diào)節(jié)NF-κB通路激活并引起c-Rel蛋白的降解，導(dǎo)致c-Rel在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)下降，最終抑制濾泡性輔助性T細(xì)胞的增殖及淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化。Liu等［21］研究表明，miRNA-155通過(guò)Peli1/c-Rel途徑調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞的數(shù)量和功能。Qiu等［6］研究也表明，miRNA-21通過(guò)Peli1/c-Rel途徑促進(jìn)致病性輔助性T細(xì)胞17的葡萄糖代謝，導(dǎo)致自身免疫病。

綜上所述，在自身免疫性POI模型小鼠中，miRNA-21和其下游靶基因Peli1的表達(dá)降低，而Peli1通過(guò)調(diào)節(jié)Treg活性使Treg數(shù)量減少，表明miRNA-21和Peli1參與自身免疫性POI的發(fā)生和發(fā)展，這為自身免疫性POI的輔助診斷和治療提供了可能的新靶點(diǎn)。