彭 憬,袁 維,銀思涵,孫克偉
湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝病科,長沙 410007
肝纖維化是一系列慢性肝損傷的病理生理結(jié)果,是一個涉及實質(zhì)細(xì)胞(肝細(xì)胞)、肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞以及常駐和浸潤免疫細(xì)胞之間相互作用的動態(tài)過程,細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的過度積累則是其最突出的特征[1]。HSC位于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞之間的竇周隙,主要在胞漿的脂滴中儲存類視黃醇(維生素A)。激活后的HSC失去儲存類視黃醇的能力,開始增殖、收縮和分泌ECM主要成分膠原Ⅰ和Ⅲ[2]。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上的窗孔會被HSC形成的基底膜封閉,造成肝竇毛細(xì)血管化,影響血竇與肝細(xì)胞之間物質(zhì)交換[3]。近年研究發(fā)現(xiàn),NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體可在肝細(xì)胞[4]、HSC[5]、肝巨噬細(xì)胞[6]等多種細(xì)胞內(nèi)表達(dá),除介導(dǎo)HSC的激活外,還通過釋放的下游炎癥因子和引起細(xì)胞焦亡放大肝臟內(nèi)炎癥反應(yīng),形成惡性循環(huán)加重肝臟損傷和纖維化。
NLRP3是三元蛋白質(zhì),包含一個氨基端吡啉結(jié)構(gòu)域(PYD),一個中央NACHT結(jié)構(gòu)域(NAIP、CIITA、HETE和TP1)和一個羧基端富含亮氨酸重復(fù)序列(LRR)結(jié)構(gòu)域。在炎癥小體復(fù)合物組裝過程中,作為接頭蛋白的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)N端通過PYD-PYD與NLRP3連接。ASC的C端有一個caspase募集結(jié)構(gòu)域(CARD),通過CARD-CARD相互作用與procaspase-1結(jié)合,促進(jìn)后者二聚化和激活。隨后以caspase-1依賴的方式,釋放炎性介質(zhì)IL-1β和IL-18(圖1)。NLRP3炎癥小體作為胞漿內(nèi)蛋白感受器,目前認(rèn)為它的激活分兩步:首先由LPS、TNFα等啟動NLRP3和pro-IL-1β表達(dá),接著被K+外流、Ca2+內(nèi)流、線粒體功能紊亂、細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)等胞內(nèi)損傷信號激活[7-8]。影響HSC活化的因素如IL-1、TNF、ROS等[2]也能激活NLRP3炎癥小體,提示后者可能參與了HSC活化。基于NLRP3 炎癥小體激活在肝纖維化中的重要作用,NLRP3有望成為臨床治療的新靶點。
注:微生物組成部分和內(nèi)源性損傷因子提供啟動信號,導(dǎo)致關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活,隨后上調(diào)NLRP3和pro-IL-1β表達(dá)。細(xì)胞外ATP、K+外流、Ca2+內(nèi)流、ROS的產(chǎn)生、溶酶體損傷、顆粒物質(zhì)等激活NLRP3炎癥小體。dsRNA,雙鏈RNA;TLR4,Toll樣受體4;ROS,活性氧;Ox-mtDNA,氧化線粒體DNA;TXNIP,硫氧還蛋白互作蛋白;TWIK2,弱內(nèi)向整流二孔K+通道2;TRPM2,瞬時受體電位M2通道;P2X7R,嘌呤能離子通道型受體7;MAVS,線粒體抗病毒信號蛋白;CLIC,胞內(nèi)氯離子通道。
活化的HSC是肝纖維化過程的關(guān)鍵細(xì)胞,研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體可通過多條通路激活HSC(圖2),促進(jìn)其α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和膠原等激活標(biāo)志的表達(dá),引起肝纖維化。
注:NF-κB,核因子κB;MyD88,髓樣分化因子88;MAPK,絲裂原活化蛋白激酶;Dectin-1,樹突狀細(xì)胞相關(guān)C型凝集素-1;ERβ,雌激素受體β;ASK1,凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1;Syk脾酪氨酸激酶;SEA,日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原;p66Shc,66 kDa原癌基因Src膠原同源物(Shc)銜接蛋白。
1.1 TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信號通路 用LPS刺激HSC上TLR4,能活化下游NF-κB炎癥信號通路[9],而NF-κB作為關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,能提供啟動信號,上調(diào)NLRP3和pro-IL-1β表達(dá)。棕櫚酸(PA)通過刺激TLR4/NF-κB信號通路,激活HSC中的NLRP3炎癥小體并向纖維化表型轉(zhuǎn)變。另外被此信號通路激活的NLRP3炎癥小體,加劇了高脂肪飲食喂養(yǎng)的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)大鼠向肝纖維化的轉(zhuǎn)變[10]。血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)通過 TLR4/MyD88/NF-κB通路促進(jìn)NLRP3和pro-IL-1β的表達(dá),促進(jìn)HSC的激活。此外,IL-1β還能協(xié)助Ang Ⅱ增加TLR4、MyD88和Ⅰ型膠原Α1(collagen type Ⅰ alpha 1,Col1a1)蛋白水平的表達(dá)[11]。TLR4模式識別受體是固有免疫識別各種病原體的重要組成部分,能識別多種內(nèi)源性和外源性配體,刺激表達(dá)在HSC上的TLR4使其活化,可能在多種肝臟疾病纖維化進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。
1.2 嘌呤能離子通道型受體7(P2X7R)/NLRP3信號通路 P2X7R能被受損細(xì)胞釋放的ATP激活,在NLRP3炎癥小體激活的第二信號中起關(guān)鍵作用。在LPS/ATP雙重信號刺激下,LX-2 細(xì)胞(人肝星形細(xì)胞系)中NLRP3炎癥小體各組成部分顯著上調(diào),用選擇性P2X7R拮抗劑A438079或P2RX7 siRNA能抑制HSC中NLRP3炎癥小體的表達(dá)和ECM的合成與沉積[12]。P2X7R的過表達(dá)還降低了LX-2細(xì)胞激活的閾值[13]。乙醇主要在肝細(xì)胞中代謝,但過量的乙醇積累能損傷肝細(xì)胞,使其釋放ATP[14]。一項研究[15]顯示在慢性酒精性肝纖維化和急性酒精性肝損傷小鼠模型中,P2X7R及相關(guān)基因的表達(dá)均上調(diào),HSC內(nèi)此通路的激活還可以使其自分泌IL-6、TNFα等炎癥因子以及激活靜止HSC成為肌成纖維細(xì)胞的TGFβ。這顯示在酒精性肝病中,肝細(xì)胞與HSC之間的相互作用除能通過P2X7R直接激活HSC外,還可以介導(dǎo)炎癥,在纖維化的發(fā)展中具有重要作用。
1.3 硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP)/NLRP3信號通路 在靜息狀態(tài)下,TXNIP與其配體結(jié)合并使其處于非活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞氧化應(yīng)激時,被誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS觸發(fā)TXNIP與硫氧還原蛋白解離,結(jié)合并激活NLRP3炎癥小體[16]。TXNIP的敲低抑制HSC激活,而TXNIP過表達(dá)則增強(qiáng)HSC激活,并且這種方式是通過HSC內(nèi)氧化應(yīng)激調(diào)控的[17]。在日本血吸蟲誘導(dǎo)的肝臟肉芽腫和肝纖維化小鼠模型中,肝臟組織中TXNIP的表達(dá)水平增加,并與NLRP3炎癥小體相互作用,促進(jìn)HSC α-SMA和膠原Ⅰ和Ⅲ表達(dá)增加[18]。TXNIP與HSC內(nèi)氧化應(yīng)激水平密切相關(guān),許多有害刺激都能引起細(xì)胞氧化應(yīng)激,TXNIP作為廣泛表達(dá)的蛋白,研究其在HSC激活中作用的文獻(xiàn)較少,有待進(jìn)一步深入。
1.4 p66Shc/mito-ROS/NLRP3信號通路 p66Shc(Shc的66 kDa蛋白亞型)是線粒體活性氧(mito-ROS)產(chǎn)生的主要調(diào)節(jié)因子,是肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的關(guān)鍵介質(zhì)。應(yīng)激刺激后,在胞漿中激活并磷酸化的p66Shc轉(zhuǎn)移到線粒體膜間隙,結(jié)合并氧化細(xì)胞色素c產(chǎn)生大量的mito-ROS[19]。p66Shc基因的敲低使HSC超氧化物歧化酶表達(dá)和活性顯著增加,以及H2O2、mito-ROS水平和線粒體細(xì)胞色素c釋放急劇減少,維持線粒體膜正常電位,改善TGFβ1引起的氧化應(yīng)激,此外NLRP3炎癥小體復(fù)合物組成部分表達(dá)也下調(diào)。p66Shc過度表達(dá)使HSC中激活標(biāo)志物如結(jié)締組織生長因子(CTGF)、α-SMA、Col1a1和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP1)表達(dá)增加,通過NLRP3的敲低則會減弱這種效果[20]。mito-ROS占細(xì)胞內(nèi)ROS絕大部分來源,因此在氧化應(yīng)激中p66Shc可能通過促進(jìn)mito-ROS形成介導(dǎo)HSC活化。
1.5 E2/雌激素受體β(ERβ)/MAPK/NLRP3信號通路 ERβ激動劑二芳基丙腈(DPN)能抑制HSC活化,以及血小板衍生生長因子誘導(dǎo)的HSC增殖[21]。TGFβ能減少ERβ在HSC細(xì)胞膜上的表達(dá),并且ERβ的選擇性抑制劑四氯乙烯(THC)增強(qiáng)了NLRP3的激活[22]。在H2O2誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞氧化應(yīng)激中,三個MAPK蛋白(p-ERK、p-JNK和p-p38)磷酸化顯著增加,雌二醇(E2)處理組能下調(diào)它們的表達(dá),THC則能完全抑制E2的作用,而ERα選擇性抑制劑甲基哌啶吡唑(MPP)卻無此效果[23]。綜上所述,說明E2主要通過ERβ發(fā)揮抑制肝纖維化的作用。這可能也解釋了在絕經(jīng)前,同齡的女性肝纖維化程度較輕,而絕經(jīng)后這一保護(hù)作用卻消失[24]。
1.6 Dectin-1/Syk/NLRP3信號通路 樹突狀細(xì)胞相關(guān)C型凝集素-1(DC-associated C-type lectin-1,Dectin-1)是細(xì)胞膜蛋白,可依賴其下游信號脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生,觸發(fā)NLRP3炎癥小體組裝[25]。用Dectin-1阻滯劑預(yù)處理小鼠HSC,阻止了日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)誘導(dǎo)的caspase-1和IL-1β的產(chǎn)生。Syk基因的沉默則抑制了NLRP3和caspase-1在HSC中的聚集[26],考慮到Syk能使ASC第146 和第187位酪氨酸殘基磷酸化,這一過程能增強(qiáng)ASC寡聚化并招募procaspase-1[27],推測上述實驗結(jié)果可能是Syk可與作為接頭的ASC直接結(jié)合,促進(jìn)炎癥小體復(fù)合物形成有關(guān)。NLRP3基因的沉默顯著抑制SEA刺激小鼠HSC向纖維化表型改變[26],提示Syk可通過ROS的產(chǎn)生和直接促進(jìn)炎癥小體復(fù)合物的形成,在此通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
1.7 ASK1/JNK/NLRP3信號通路 ASK1能被ROS、LPS、細(xì)胞因子等各種刺激活化,隨后磷酸化JNK[28],而p-JNK可以使NLRP3第194位絲氨酸磷酸化(人是198位),促進(jìn)NLRP3炎癥小體的自結(jié)合和激活[29]。ASK1/JNK通路能促進(jìn)HSC增殖和活化,加重大鼠肝纖維化和炎癥反應(yīng)[28]。在他莫昔芬誘導(dǎo)激活的NLRP3突變體敲入(Nlrp3-KI)小鼠,口服ASK1抑制劑GS-444217能降低肝組織磷酸化ASK1、c-Jun的表達(dá),抑制肝細(xì)胞的死亡和肝纖維化。Nlrp3-KI小鼠分離的Kupffer細(xì)胞中促炎基因TNFα、IL-1β及HSC中促纖維化基因Col1a1、肌動蛋白α2的表達(dá)增強(qiáng),而ASK1的抑制能使上述基因的表達(dá)減弱[30]。在一項多中心二期臨床實驗,ASK1選擇性抑制劑selonsertib能改善NASH患者2期或3期肝纖維化和肝小葉炎癥[31],顯示此通路的激活與肝臟炎癥反應(yīng)和纖維化密切相關(guān)。
肝臟炎癥微環(huán)境由Kupffer細(xì)胞、浸潤的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞及其分泌的炎性介質(zhì)構(gòu)成。而其中巨噬細(xì)胞在促進(jìn)HSC活化中至關(guān)重要,激活后不僅能分泌炎癥因子[32],作為CXCL2的主要來源,還能募集中性粒細(xì)胞[33]。而NLRP3炎癥小體的激活能促進(jìn)肝臟炎癥微環(huán)境的形成,進(jìn)而使HSC活化。
2.1 肝臟巨噬細(xì)胞 與HSC中NLRP3炎癥小體的激活會誘導(dǎo)其向纖維化表型轉(zhuǎn)變不同,巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活可使大量炎癥因子釋放到胞外,進(jìn)而促進(jìn)HSC活化。在膽石酸(LCA)+Nigericin刺激下,Kupffer細(xì)胞內(nèi)ROS的增加能激活NLRP3炎癥小體,使得M1表型標(biāo)志Tnf、iNos表達(dá)增加,M2表型標(biāo)志Arg1表達(dá)下調(diào)[34]。而應(yīng)用NLRP3的抑制劑MCC950,使肝臟極化巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)變[35],以上實驗提示在巨噬細(xì)胞向促炎性表型轉(zhuǎn)換中,NLRP3炎癥小體的激活起重要作用。M1型巨噬細(xì)胞分泌的TNFα[36]、IL-6[37]等炎癥因子可促進(jìn)HSC的激活,而分泌的IL-1β作用于HSC上的P2X7R,可以使其維持在激活狀態(tài)[13]。不同于前述巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的激活促進(jìn)HSC活化,巨噬細(xì)胞分泌的CXCL2可以作用于LX-2細(xì)胞上受體CXCR2,介導(dǎo)HSC內(nèi)NLRP3炎癥小體激活使其活化[38]。
2.2 中性粒細(xì)胞 NLRP3炎癥小體在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的激活,可以上調(diào)中性粒細(xì)胞關(guān)鍵趨化因子CXCL1(20倍)和CXCL2(30倍)的mRNA表達(dá)[39]。NLRP3基因敲除的小鼠肝臟髓過氧化物酶(MPO)+細(xì)胞(中性粒細(xì)胞)滲入減少[34],表明NLRP3炎癥小體的激活可募集中性粒細(xì)胞到肝臟,加重炎癥反應(yīng)。HSC可被募集到肝臟的中性粒細(xì)胞,產(chǎn)生的ROS激活,并分泌粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和IL-15,延長中性粒細(xì)胞的生存[40],提示中性粒細(xì)胞與HSC之間存在正反饋回路,促進(jìn)肝臟損傷和纖維化。
2.3 IL-1β和IL-18 NLRP3炎癥小體下游信號IL-1β和IL-18也可以介導(dǎo)炎癥反應(yīng),但I(xiàn)L-1β還能與HSC相互作用促進(jìn)其激活。IL-1β介導(dǎo)TGFβ以自分泌方式在LX-2細(xì)胞表達(dá)[41],造成ECM沉積和NLRP3炎癥小體活化的第二信號如P2X7R激活及Ca2+內(nèi)流增加[13],顯示存在正反饋環(huán)路促進(jìn)HSC的激活。用IL-1β受體阻滯劑rIL-1Ra預(yù)處理HSC-T6細(xì)胞,E.coli RNA誘導(dǎo)產(chǎn)生的TGFβ1的分泌明顯降低,細(xì)胞內(nèi)α-SMA、COL1A1和TIMP-1的mRNA表達(dá)被顯著抑制[42]。上述研究發(fā)現(xiàn)IL-1β能影響HSC的TGFβ分泌和活化,其機(jī)制在于IL-1β能活化NF-κB亞基p65和轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)亞基c-Jun,分別結(jié)合到TGFβ啟動子κB3和AP-1-3位點,提高組蛋白H4和H3乙酰化水平,募集RNA聚合酶Ⅱ啟動TGFβ基因轉(zhuǎn)錄[43]。此外IL-1β還能通過JNK/AP-1通路誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HSC增殖,但在小鼠體內(nèi)卻不明顯[44-45]。
NLRP3炎癥小體在多種肝臟疾病中都可表達(dá),與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[4,46],可作為肝組織炎癥和損傷的檢測指標(biāo)。NLRP3炎癥小體通過HSC內(nèi)氧化應(yīng)激、炎性信號等,促進(jìn)由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、IL-1β等構(gòu)成的炎癥微環(huán)境的形成,從而形成錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)使HSC活化。
盡管上述眾多研究表明NLRP3與HSC的活化相關(guān),但研制針對肝纖維化的NLRP3抑制劑較少,例如NT-0167(MCC950衍生物)應(yīng)用于肝纖維化仍處于臨床前研究,療效尚不清楚[47]。MCC950能非競爭性抑制碳酸酐酶2活性,造成脫靶[48],這也限制了MCC950及其衍生物在臨床上的應(yīng)用。由于NLRP3炎性小體有復(fù)雜的信號級聯(lián)放大效應(yīng),可以使用多種靶點來抑制NLRP3炎癥小體。在個案報道中,用秋水仙堿常規(guī)治療地中海熱的基礎(chǔ)上聯(lián)合IL-1β中和抗體canakinumab,可使進(jìn)展為NASH的患者轉(zhuǎn)氨酶降為正常,顯著改善肝纖維化[49],顯示了積極的抗肝纖維化效果。但由于對NLRP3阻滯劑作用機(jī)制的理解不足,以及這些分子的潛在脫靶效應(yīng)限制了它們進(jìn)一步的臨床應(yīng)用,選擇NLRP3分子特異結(jié)構(gòu)設(shè)計藥物和提高對HSC的靶向性將是有意義的探索。
利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻(xiàn)聲明:彭憬、孫克偉參與起草和修改文章關(guān)鍵內(nèi)容;袁維、銀思涵對研究的思路有關(guān)鍵貢獻(xiàn)。