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      HPLC法同時測定乳酸中L-乳酸及6種有機酸雜質的含量

      2022-11-16 08:49:36謝瑩瑩張悅劉雁鳴趙勇鄭金鳳蔣贇周穎湖南省藥品檢驗檢測研究院長沙410001國家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料工程技術研究重點實驗室長沙410001
      中南藥學 2022年10期
      關鍵詞:己二酸酒石酸有機酸

      謝瑩瑩,張悅*,劉雁鳴,趙勇,鄭金鳳,蔣贇,周穎(1.湖南省藥品檢驗檢測研究院,長沙 410001;2.國家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料工程技術研究重點實驗室,長沙 410001)

      乳酸又名2-羥基丙酸,是一種天然存在的重要有機酸,作為消毒防腐劑、pH 調節(jié)劑、助溶劑等,可用于肌內注射、靜脈注射、皮下注射、口服糖漿、片劑、外用和陰道用制劑[1-2]。乳酸按其旋光性通常可以分為D-乳酸、L-乳酸以及外消旋型DL-乳酸3 種,因人體內只有L-乳酸脫氫酶可分解自身產生或攝入的L-乳酸,如過量攝入D型、DL型乳酸會產生酸中毒等代謝紊亂癥狀,故醫(yī)藥行業(yè)原輔料只用L-乳酸[3-4]。乳酸在發(fā)酵過程時,伴隨產物乳酸生成的同時還有其他一些有機酸副產物,有機酸的含量是評價發(fā)酵工藝的重要指標[5-6]。其中《中國藥典》2020年版乳酸品種項下采用化學反應控制枸櫞酸、草酸、磷酸或酒石酸項[7];日本藥典(JP17.0)對揮發(fā)性脂肪酸進行了控制[8]。為明確乳酸中可能含有的有機酸類型,參考相關文獻[9-10],建立了HPLC-UV 法測定乳酸中其他有機酸,并采用液質聯用確認L-乳酸二聚體的結構,確定該方法可有效排除影響有機酸分離因素的干擾,具有檢測限低、重現性好的特點,可以用于乳酸的質量控制,現報道如下。

      1 材料

      LC-20A 島津高效液相色譜儀(日本島津);MS105DU 電子天平(瑞士Mettler-Toledo 公司)。草酸(批號:101097-201702,純度:100.0%)、檸檬酸(批號:111679-201602,純度:97.0%)、冰醋酸(批號:190079-202002,純度:99.9%)對照品(中國食品藥品檢定研究院);酒石酸(批號:20180923)、己二酸(批號:20190407)、磷酸(批號:20200108)對照品(均為優(yōu)級純,國藥集團化學試劑有限公司);L-乳酸對照品(批號:LRAC 7354,純度:93.3%,Sigma-Alorich 公司);水為實驗室自制超純水。

      2 方法與結果

      2.1 色譜條件

      色譜柱:Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm,9 μm);流動相:5 mmol·L-1H2SO4;流速:0.6 mL·min-1;檢測波長:210 nm;柱溫:55℃;進樣量:10 μL。

      2.2 溶液的制備

      2.2.1 供試品溶液制備 取本品0.25 g,精密稱定,置50 mL 量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,即得。

      2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取磷酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、L-乳酸、冰醋酸、己二酸對照品各適量,加流動相溶解,并逐步稀釋得到系列標準工作溶液(STD1~STD5)(見表1)。

      表1 7 種物質的標準工作溶液(mg·mL-1)Tab 1 Standard working solution of 7 substances (mg·mL-1)

      2.3 系統適用性試驗

      取空白溶液(流動相)、供試品溶液、對照品溶液(STD3),進樣測定,記錄色譜圖,結果顯示,空白溶液對樣品測定無干擾,各成分之間分離度均能達到藥典要求[11]。典型圖譜見圖1。

      圖1 對照品溶液(A)、空白溶液(B)和供試品溶液(C)色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of reference solution(A),blank solution(B)and test solution(C)

      2.4 線性關系的考察

      取“2.2.2”項下的系列標準工作溶液,進樣測定,記錄色譜圖,以質量濃度對相應的峰面積進行回歸,結果見表2。

      表2 各成分線性關系Tab 2 Linearity of various constituents

      2.5 精密度試驗

      取“2.2.2”項下STD3 標準工作溶液,連續(xù)進樣6 次,結果磷酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、L-乳酸、冰醋酸、己二酸峰面積RSD分別為0.23%、0.036%、0.14%、0.11%、0.064%、0.13%、0.52%。

      2.6 重復性試驗

      取本品(批號:CD190602C)按“2.2.1”項下方法平行制備6 份供試品溶液,進樣測定,計算含量,結果雜質僅檢出己二酸,含量為0.22%,RSD為4.7%,L-乳酸含量為64.5%,RSD為0.86%。

      2.7 穩(wěn)定性試驗

      取“2.6”項下供試品溶液和“2.2.2”項下的STD3 溶液在室溫(25℃)放置0、2、4、6、8、12、24 h 后測定,結果各成分峰面積的RSD均小于5%,說明供試品及對照品溶液在24 h 內穩(wěn)定。

      2.8 定量限、檢測限

      取“2.2.2”項下STD1 溶液適量,逐級稀釋,并進樣測定,以信噪比S/N=10 和S/N=3 時各對照品的量為定量限和檢測限,結果除主峰(L-乳酸)外,各雜質磷酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、冰醋酸、己二酸檢測限分別為2.7、0.15、2.0、5.2、5.4、7.6 μg·mL-1;定量限分別為9.1、0.50、6.9、17.6、18.2、25.5 μg·mL-1。

      2.9 回收試驗

      分別稱取本品(批號:CD190602C)適量,精密稱定,置50 mL 量瓶中,分別依次加入磷酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、L-乳酸、冰醋酸、己二酸對照品各適量,用流動相稀釋并定容至刻度,平行制備6 份;分別精密量取上述溶液各10 μL 進樣測定,并計算回收率,結果磷酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、L-乳酸、冰醋酸、己二酸的平均回收率分別為103.1%、102.5%、101.5%、100.5%、99.8%、96.2%、101.1%,RSD分別為1.4%、0.80%、1.1%、0.26%、0.59%、0.23%、0.36%。

      2.10 耐用性考察

      改變柱溫(±5℃)、流速(±0.2 mL·min-1)和不同品牌的液相色譜儀,結果不同品牌的儀器對結果無影響;柱溫和流速會影響各組分間的分離,但各組分間的最低分離度均大于1,能夠基本分離,對結果無明顯影響,表明該方法耐用性較好。

      2.11 樣品測定

      取33 批乳酸樣品各適量,分別按“2.2.1”項下方法制備,再進樣測定,計算樣品中有機酸含量,結果見表3。

      表3 樣品中的L-乳酸單體及 6 種有機酸雜質檢驗結果(%)Tab 3 Test results of L-lactic acid monomer and 6 organic acid impurities (%)

      2.12 液質聯用確認主峰附近峰的結構

      2.12.1 液相色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流速:0.3 mL·min-1;柱溫:30℃;流動相:0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫,程序見表4。

      表4 梯度洗脫表Tab 4 Gradient elution

      2.12.2 質譜條件 離子源:電噴霧離子源(ESI);源電壓4 kV;氮氣流速:3 L·min-1;加熱氣流速:10 L·min-1;干燥器氣流速:10 L·min-1;接口溫度:300℃;離子傳輸管溫度:250℃;加熱模塊溫度:400 ℃,負離子模式;一級質譜掃描范圍50~1000;二級質譜碰撞電壓:15 eV。

      2.12.3 供試品的制備 單獨收集圖1中供試品溶液的峰8 組分,作為供試品溶液。

      2.12.4L-乳酸對照品溶液 取L-乳酸對照品10 mg,加水溶解并稀釋成1 μg·mL-1的溶液,即得。

      2.12.5 碎片離子確認 精密量取供試品溶液、L-乳酸對照品溶液各3 μL,注入液質聯用色譜儀,記錄質譜圖。結果顯示,峰8 母離子一級質譜圖中出現了m/z161.15,推測峰8 可能為兩個乳酸分子聚合,脫去一分子水,生成乳酸二聚體,分子量為162,在負離子模式下[M-H]-為161。峰8 母離子經碰撞室碰撞后生成了m/z89.45 的碎片離子,即為L-乳酸的碎片離子,證實峰8 為乳酸二聚體。

      3 討論

      3.1 檢測器的選擇

      有文獻[12]提出有機酸的檢測可采用示差檢測器,故課題組對該文獻方法進行優(yōu)化,使各成分分離能基本達到《中國藥典》2020年版四部通則0512分離度的要求后,采用同一混合標準溶液在示差檢測器和紫外檢測器上進行測定,結果7 個成分在示差檢測器上的檢測限明顯高于紫外檢測器,且示差檢測器影響因素多,所以選擇紫外檢測器進行檢測。

      3.2 檢測波長的選擇

      對6 種有機酸雜質及L-乳酸的標準溶液進行波長全掃描,發(fā)現各成分在210 nm 附近均有最大吸收,所以選取210 nm 作為檢測波長。

      3.3 結論

      該方法不僅可檢測出乳酸中6 種有機酸雜質,還可將L-乳酸單體及L-乳酸二聚體區(qū)分開來,而《中國藥典》2020年版乳酸品種項下[7]的含量測定采用滴定法,其原理是用過量氫氧化鈉將乳酸中聚合體水解成乳酸單體后,再用硫酸滴定液返滴定,測定的是樣品中乳酸及其聚合體的總和,不能反映樣品中乳酸單體的含量;乳酸在高濃度下會發(fā)生聚合反應,生成乳酸聚合體[13],與現行標準對乳酸的定義相吻合,因此該方法測定L-乳酸單體含量相比于滴定法專屬性更強。

      4 小結

      本研究建立了一種可有效檢測乳酸中L-乳酸單體及6 種有機酸雜質的高效液相色譜法,該方法簡便、準確,可有效分離各有機酸雜質并應用于乳酸中L-乳酸單體的批量檢測,為乳酸標準的科學性和質量可控性提供參考。

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