清熱養(yǎng)陰除濕丸調(diào)控焦亡通路治療痛風(fēng)的作用機(jī)制

溫 博 馬 叢 張 秦 施 陽 劉密鳳 霍曉萌 顧 文 邵培培

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕病科，北京，100010)

痛風(fēng)是與循環(huán)中尿酸過多導(dǎo)致單鈉尿酸鹽結(jié)晶沉積于組織有關(guān)的一種代謝性疾病[1]。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(Acute Gouty Arthritis,AGA)是開始于滑膜的劇烈炎癥反應(yīng)，單鈉尿酸鹽結(jié)晶沉積于關(guān)節(jié)及周圍組織，以炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、關(guān)節(jié)腫脹和劇烈疼痛為主要臨床特征的一種急性風(fēng)濕性疾病。這一過程的主要組織學(xué)特征為滑膜襯里細(xì)胞增殖，以及中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)[2]。有關(guān)痛風(fēng)的發(fā)作機(jī)制研究得較為深入，巨噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬單鈉尿酸鹽結(jié)晶造成無效吞噬，導(dǎo)致溶酶體損傷，進(jìn)而引起NEK7-核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(Nucleotide-binding Oligomerization Domain-like Receptor Protein 3,NLRP3)復(fù)合物形成，激活NLRP3炎癥小體形成，釋放大量白細(xì)胞介素-1β等炎癥介質(zhì)，是啟動(dòng)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性炎癥反應(yīng)的重要途徑；另一方面，單鈉尿酸鹽可以通過誘導(dǎo)活性氧直接激活NLRP3炎癥小體，促使pro-胱天蛋白酶-1(Caspase-1)成熟，切割成孔蛋白Gasdermin-D(GSDMD)的同時(shí)活化白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-18而介導(dǎo)細(xì)胞焦亡[3]。

清熱養(yǎng)陰除濕丸是根據(jù)研究單位已故名老中醫(yī)王為蘭教授所創(chuàng)清熱養(yǎng)陰除濕方研制的院內(nèi)制劑，臨床應(yīng)用十余載，廣泛用于多種風(fēng)濕性疾病活動(dòng)期的治療，收到較好臨床療效[4-7]。清熱養(yǎng)陰除濕丸由金銀花、連翹、半枝蓮、虎杖、白鮮皮、土茯苓、白芍、生熟地黃、桂枝、川烏組成。前期的研究提示清熱養(yǎng)陰除濕丸能提高小鼠痛閾值；對(duì)小鼠炎性耳郭腫脹和足腫脹均有抑制作用，該藥抗炎消腫止痛作用可能與減少炎癥介質(zhì)有關(guān)[8-9]?；诖?，我們用改良的Coderre法制造痛風(fēng)動(dòng)物模型[10]，觀察清熱養(yǎng)陰除濕丸對(duì)NEK7/GSDMD通路的干預(yù)情況以及相關(guān)炎癥介質(zhì)的影響，探討清熱養(yǎng)陰除濕丸可能的作用機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用該藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取雄性SD大鼠50只(購(gòu)自北京維通利華)，體質(zhì)量180～220 g，6～8周齡，合格證號(hào)(11400700382137)。分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境室溫22～24 ℃，自由飲食、飲水，自然晝夜節(jié)律光照，定期更換墊料。本研究通過倫理委員會(huì)審批(倫理審批號(hào)：IRM-DWLL-2019048)。

1.1.2 藥物 尿酸鈉(Sigma，美國(guó)，批號(hào)：BCBW1849)；吐溫80(北京索萊寶，批號(hào)：822L0419)；清熱養(yǎng)陰除濕丸(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，批號(hào)：1811035)；秋水仙堿(昆藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：180705-01)。

1.1.3 試劑與儀器 試劑：TIANScript RT KIT(天根生物科技有限公司，貨號(hào)：Cat# KR104-02)；SuperReal PreMix Plus(天根生物科技有限公司，貨號(hào)：Cat# FP205)；Trizol(Invitrogen，美國(guó)，貨號(hào)：15596-026)；BCA蛋白定量試劑盒(艾德卡公司，德國(guó)，批號(hào)：PP0102)，Anti-NLRP3抗體(Ambion公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab214185)，Anti-NEK7抗體(Ambion公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab133514)，β-Actin antibody(天津三箭公司，批號(hào)：KM9001)，Anti-ASCCantibody(santa cruz biotechnology公司，美國(guó)，貨號(hào)：SC-514414)，Anti-Caspase-1抗體(Ambion公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab1872)，Anti-GSDMD抗體(Ambion公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab219800)。儀器：鼠足趾容積測(cè)量?jī)x(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：YLS-7C)，手持式勻漿機(jī)(上海凈信實(shí)驗(yàn)設(shè)備科技部，型號(hào)：F6/10)，渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：QL-902)，生物分光光度計(jì)(Eppendorf，德國(guó)，型號(hào)：BioPhotometer)，熒光定量PCR儀(BIO-RAD，美國(guó)，型號(hào)：Connect CFXTM)，高速離心機(jī)(Eppendorf，型號(hào)：5427R)，離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó)，型號(hào)：Centrifuge 5415D)，低溫離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó),型號(hào)：5418R)，轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司,型號(hào)：TS-8)，垂直電泳槽(北京六一儀器廠，型號(hào)：DYCZ-20C)，轉(zhuǎn)移槽(北京六一儀器廠,型號(hào)：DYCP-40C，)，顯微鏡(日本奧林巴斯，日本，型號(hào)：BX51T-PHD-J11)，多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)(Media Cybernetics公司，美國(guó)，型號(hào)：Image-Pro Plus)，石蠟切片機(jī)(萊卡公司，德國(guó)，型號(hào)：RM2015)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 用改良的Coderre法制造痛風(fēng)動(dòng)物模型[10]。乙醚麻醉大鼠后，用6號(hào)注射針在大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)后側(cè)沿跟腱內(nèi)側(cè)以30°～40°方向插入至關(guān)節(jié)腔,向空白對(duì)照組大鼠右踝關(guān)節(jié)注入生理鹽水50 μL，其余各組別大鼠的關(guān)節(jié)腔均注入50 μL濃度為25 g/L的尿酸鈉混懸液，以關(guān)節(jié)囊對(duì)側(cè)鼓起為注入標(biāo)準(zhǔn)，隨后在關(guān)節(jié)腔注射部位涂少量紅霉素軟膏預(yù)防感染。連續(xù)注射生理鹽水及尿酸鈉溶液3 d。造模成功的表現(xiàn)：所有大鼠模型制備后大鼠步態(tài)、關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)顯著高于正常組，說明造模成功。將50只大鼠隨機(jī)分為6組即空白對(duì)照組(BC)、模型組、清熱養(yǎng)陰除濕丸劑低劑量觀察組(MSD1)、中劑量觀察組(MSD2)及高劑量觀察組(MSD3)、秋水仙堿組(PC)，每組8只。

1.2.2 給藥方法 BC及模型組每日以生理鹽水灌胃，3 mL/次，2次/d；成藥清熱養(yǎng)陰除濕丸每袋裝6 g，成人用量2袋/次，3次/d；根據(jù)成人與老鼠體表面積換算關(guān)系及預(yù)實(shí)驗(yàn)情況，MSD2組為3.2 g/kg；秋水仙堿片每日成人最大劑量不超過6 mg，根據(jù)成人與老鼠體表面積換算關(guān)系及預(yù)實(shí)驗(yàn)情況，秋水仙堿用量為6×10-4g/kg。MSD1、MSD2、MSD3分別以1.6 g/kg、3.2 g/kg、6.4 g/kg的劑量給大鼠灌服清熱養(yǎng)陰除濕丸混懸液(濃度分別為0.06 g/mL、0.12 g/mL、0.24 g/mL)，3 mL/次，2次/d，連續(xù)7 d；秋水仙堿組按6×10-4g/kg的劑量給大鼠灌服秋水仙堿混懸液濃度0.02 g/L，6 mL/次,2次/d，連續(xù)7 d。其間，各組大鼠均自由飲水及正常飲食。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 各組動(dòng)物第5天灌胃1 h后，進(jìn)行造模，造模6 h、12 h、24 h、48 h測(cè)量大鼠踝關(guān)節(jié)周徑，計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)；造模3 d后進(jìn)行其他指標(biāo)觀察。關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)=測(cè)定時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)周長(zhǎng)-初始周長(zhǎng)/初始周長(zhǎng)，初始周長(zhǎng)即0 h時(shí)周長(zhǎng)。

在灌胃第7天即第3天誘導(dǎo)模型后1 h收集血清和組織樣本。乙醚麻醉，無菌條件下經(jīng)腹腔抽取靜脈血3 mL，室溫下放置20 min后，置于離心機(jī)中3 000 r/min,離心半徑7 cm，離心10 min，收集血清，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。取完血后，用頸椎脫臼法將其處死。以大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)為中心前后0.5 cm剪斷，去皮，在冰板上快速小心地分離踝關(guān)節(jié)的滑膜組織，并進(jìn)行分裝，一部分置于10%甲醛溶液中固定24 h以上用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)，另一部分分裝入冷凍管于-80 ℃冰箱下儲(chǔ)存用于蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。

取出保存的踝關(guān)節(jié)滑膜組織，用Trizol提取組織樣本中總RNA，取5 μLRNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)RNA的完整性；用TIANScript RT KIT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行；將β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，在CFX manager軟件上按照2-△△Ct法進(jìn)行基因相對(duì)定量分析。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具體引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

將滑膜組織剪成小塊，按照每20 mg組織加200～400 μL的比例加入裂解液。用手握式電動(dòng)組織細(xì)胞勻漿器勻漿約1 min或直至充分裂解。12 000 r/min，離心半徑11 cm，離心10 min，取上清，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定各樣本蛋白含量，具體步驟參見產(chǎn)品說明書。制備10%分離膠，4%濃縮膠，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與5×緩沖液凝膠電泳上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移膜置于5%脫脂奶粉，室溫、搖床上緩慢搖動(dòng)狀態(tài)下封閉1 h，抗體：細(xì)胞凋亡相關(guān)斑樣蛋白(Apoptosis-associated Speck-like Protein,ASC)(1∶300)、Caspase-1(1∶300)、NLRP3(1∶800)、NEK7(1∶10 000)、GSDMD(1∶800)、β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；用1×TBST洗滌3次，10 min/次，加入二抗(1∶3 000)中，室溫、避光緩慢搖動(dòng)作用60 min，用1×TBST洗膜3次，10 min/次；曝光及洗片后，采用Image J軟件分析灰度值。

取常規(guī)制備踝關(guān)節(jié)石蠟組織切片，脫蠟后置于檸檬酸鹽緩沖液(pH值為6.0)中10 min進(jìn)行抗原熱修復(fù)，磷酸鹽緩沖液清洗后，加入3%過氧化氫溶液常溫下放置25 min，磷酸鹽緩沖液清洗3次，5 min/次，滴加山羊血清反應(yīng)20 min，加ASC(1∶150)、胱天蛋白酶-1(1∶200)、NEK7(1∶300)、NLRP3(1∶500)、GSDMD(1∶800)，β-actin(1∶1 000)，4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5 min，加入中杉金橋即用型二抗(SP-9000型)，37 ℃條件下20 min，用磷酸鹽緩沖液清洗3次×5 min；切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37 ℃ 20 min，磷酸鹽緩沖液清洗3次×5 min；DAB顯色后充分水洗；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1 min，充分水洗、1%鹽酸乙醇分化、1%氨水反藍(lán)、充分水洗、經(jīng)70%乙醇5 min、80%乙醇5 min、90%乙醇5 min 2次、95%乙醇5 min 2次、100%乙醇5 min 2次脫水、二甲苯透明5 min 2次、中性樹脂封片，顯微鏡下觀察結(jié)果，記錄各組免疫組化評(píng)分(Immunohistochemical Score，IHS)。

IHS[11]=陽性細(xì)胞數(shù)積分(A)×陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度積分(B)。

A為陽性細(xì)胞數(shù)積分0～1%=0分、1%～10%=1分、10%～50%=2分、50%～80%=3分、80%～100%=4分；B為陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度積分0分(陰性)、1分(弱陽性)、2分(陽性)、3分(強(qiáng)陽性)。

2 結(jié)果

2.1 清熱養(yǎng)陰除濕丸對(duì)各組大鼠關(guān)節(jié)的影響 造模前各組大鼠踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)基本相同，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。造模6 h后除BC組，每組模型大鼠均出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫，活動(dòng)減少，舔足等現(xiàn)象。且各組大鼠腫脹度較造模前均有增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

造模12 h后，與BC組比較，其余各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，PC組降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，余藥物處理組腫脹指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與PC組比較，MSD1組、MSD2組、MSD3組組腫脹指數(shù)略高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

造模24 h后，與BC組比較，各組腫脹指數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，各藥物處理組關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與PC組比較，MSD1組、MSD2組、MSD3組腫脹指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

造模48 h后，與BC組比較，MSD3組踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其余各組關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，各藥物關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PC組比較，MSD3組踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)，MSD1組、MSD2組與PC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 清熱養(yǎng)陰除濕丸對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)的影響

在連續(xù)測(cè)量時(shí)間內(nèi)，與空白組比較，其余各組大鼠均有明顯踝關(guān)節(jié)腫脹；無藥物干預(yù)的BC組大鼠，關(guān)節(jié)炎癥于48 h內(nèi)達(dá)高峰；各藥物處理組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)于24 h內(nèi)達(dá)高峰，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，各藥物處理組大鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)逐漸降低，以MSD3組下降幅度最大，說明各藥物處理組均可改善大鼠的關(guān)節(jié)炎情況，而MSD3組療效更為明顯。

2.2 清熱養(yǎng)陰除濕丸對(duì)大鼠炎癥介質(zhì)的影響

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎為全身性炎癥反應(yīng)，大鼠踝關(guān)節(jié)液較少，收集關(guān)節(jié)沖洗液可能導(dǎo)致明顯的稀釋，白細(xì)胞介素-1β，白細(xì)胞介素-6，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死因子-α為下游炎癥介質(zhì)，故其在血液中的含量水平同樣可以反映關(guān)節(jié)炎的程度。

2.2.1 各組對(duì)白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6表達(dá)水平的影響 與BC組比較，其余各組表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，各藥物處理組表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PC組比較，MSD3組表達(dá)相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.1)，MSD1組、MSD2組表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2.2 各組對(duì)白細(xì)胞介素-18水平的影響 與BC組比較，各組表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，各藥物處理組表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PC組比較，MSD3組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.1)，MSD1組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2.3 各組對(duì)腫瘤壞死因子-α水平的影響 與BC組比較，其余各組表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，MSD1組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，余藥物處理組表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PC組比較，MSD3組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.3)，MSD1、MSD2組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 清熱養(yǎng)陰除濕丸對(duì)大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥介質(zhì)含量的影響

清熱養(yǎng)陰除濕丸MSD3組中白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-18、腫瘤壞死因子-α的表達(dá)較BC組、模型組明顯降低，相較于PC組，MSD3組的抑制作用更加明顯，隨著清熱養(yǎng)陰除濕丸劑量的增加，其對(duì)炎癥介質(zhì)表達(dá)的抑制作用增強(qiáng)。

2.3 清熱養(yǎng)陰除濕丸對(duì)NEK7/GSDMD通路各蛋白mRNA表達(dá)的影響 與BC組比較，各組mRNA表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，各藥物處理組mRNA表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PC組比較，MSD2、MSD3組mRNA表達(dá)接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 清熱養(yǎng)陰除濕丸對(duì)大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NEK7，NLRP3，Caspase-1，ASC，GSDMD mRNA表達(dá)的影響

清熱養(yǎng)陰除濕丸MSD3組中各關(guān)鍵蛋白mRNA表達(dá)量較BC、模型組均降低；相較于PC組，清熱養(yǎng)陰除濕丸中、高劑量組對(duì)各關(guān)鍵蛋白mRNA的表達(dá)的抑制作用無顯著差異，隨著清熱養(yǎng)陰除濕丸劑量的增加，其對(duì)各關(guān)節(jié)蛋白mRNA表達(dá)的抑制作用增強(qiáng)。

2.4 清熱養(yǎng)陰除濕丸對(duì)NEK7/GSDMD通路各關(guān)鍵蛋白表達(dá)量的影響 與BC組比較，各蛋白的表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，各藥物處理組蛋白表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PC組比較，MSD1表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MSD2、MSD3組蛋白表達(dá)相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5，圖1。

表5 清熱養(yǎng)陰除濕丸對(duì)大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NEK7、NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD表達(dá)的影響

圖1 關(guān)節(jié)滑膜組織中NEK7，NLRP3，Caspase-1，ASC，GSDMD蛋白電泳條帶

上清熱養(yǎng)陰除濕丸MSD3組中各關(guān)鍵蛋白表達(dá)量較BC、模型組均降低；相較于PC組，清熱養(yǎng)陰除濕丸中、高劑量組對(duì)各關(guān)鍵蛋白的表達(dá)的抑制作用接近，隨著清熱養(yǎng)陰除濕丸劑量的增加，其對(duì)各關(guān)節(jié)蛋白表達(dá)的抑制作用逐漸增強(qiáng)。

2.5 清熱養(yǎng)陰除濕丸對(duì)NEK7/GSDMD通路各關(guān)鍵蛋白IHS積分的影響 與BC組比較，各組表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，MSD1組表達(dá)相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，余藥物處理組表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PC組比較，MSD1、MSD2表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MSD3組表達(dá)相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

表6 清熱養(yǎng)陰除濕丸對(duì)大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NEK7、NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD IHS積分的影響分，n=8)

3 討論

痛風(fēng)是一種單水尿酸鈉沉積所致的晶體相關(guān)性關(guān)節(jié)病，與嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥直接相關(guān)，臨床主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的急性關(guān)節(jié)炎、不可逆的外周關(guān)節(jié)損傷、皮下痛風(fēng)石、痛風(fēng)性腎病、尿路結(jié)石，甚至可以造成重要臟器功能異常[12]。來自國(guó)家風(fēng)濕病數(shù)據(jù)中心的數(shù)據(jù)顯示，在痛風(fēng)發(fā)作期間，79%的患者會(huì)因疼痛和住院治療無法正常工作，嚴(yán)重影響其工作和生命質(zhì)量，痛風(fēng)帶來的經(jīng)濟(jì)社會(huì)損失不容忽視[13]。

中性粒細(xì)胞對(duì)單鈉尿酸鹽結(jié)晶的吞噬作用在痛風(fēng)發(fā)作的急性炎癥擴(kuò)大中發(fā)揮顯而易見的中心作用，但中性粒細(xì)胞募集至關(guān)節(jié)需要滑膜和關(guān)節(jié)血管中較早期局部細(xì)胞和液相事件。這些事件啟動(dòng)固有免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的炎癥，包括激活滑膜定居吞噬細(xì)胞和NLRP3炎癥小體，后者導(dǎo)致白細(xì)胞介素-1前體細(xì)胞加工過程和關(guān)鍵細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β的活化，進(jìn)而導(dǎo)致劇烈的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡(Pyroptosis)是在2001年由Cookson和Brennan等[14]研究發(fā)現(xiàn)的一種炎癥性程序性細(xì)胞死亡方式，其以Caspase-1為核心環(huán)節(jié)，GSDMD蛋白為切割底物，這是細(xì)胞焦亡的經(jīng)典激活途徑，Caspase-1由NLRP3炎癥小體復(fù)合物在感知病原信號(hào)后激活，是細(xì)胞質(zhì)天然免疫最為重要的通路之一[15-16]。

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)尿酸鹽結(jié)晶析出或痛風(fēng)石崩解后，被激活的NEK7-NLRP3炎癥復(fù)合物、Caspase-1能介導(dǎo)滑膜組織中的巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡，表現(xiàn)為細(xì)胞膜發(fā)生破裂并釋放白細(xì)胞介素-1β等炎癥介質(zhì)，協(xié)同放大強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫痛等典型痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎癥狀[17-18]。NEK7/GSDMD焦亡通路與痛風(fēng)急性炎癥的發(fā)生密切相關(guān)。從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，模型組NEK7-NLRP3-Caspase-1通路上的主要蛋白表達(dá)量及mRNA表達(dá)量均顯著高于空白組，白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-18等炎癥介質(zhì)的含量明顯高于空白組，這與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生機(jī)制相同，說明造模成功。同時(shí)也說明了NEK7/GSDMD通路在痛風(fēng)急性炎癥中的重要作用。秋水仙堿作為經(jīng)典的控制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎藥物，可以抑制NLRP3的表達(dá)，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，秋水仙堿組中NEK7/GSDMD通路各相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯低于模型組。結(jié)合動(dòng)物的關(guān)節(jié)炎評(píng)分來看，秋水仙堿組要明顯低于模型組，說明秋水仙堿可以控制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)癥狀。

清熱養(yǎng)陰除濕丸基礎(chǔ)藥理作用研究顯示，該藥能降低Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced Arthritis，CIA)大鼠足腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)，降低血清中白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α水平，提示該藥作用機(jī)制可能與降低異常升高的細(xì)胞因子，減少炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，調(diào)節(jié)促炎與抑炎細(xì)胞因子失衡有關(guān)[19]。此外，清熱養(yǎng)陰除濕丸能提高小鼠痛閾值；對(duì)小鼠炎性耳郭腫脹和足腫脹均有抑制作用，該藥抗炎消腫止痛作用可能與減少炎癥介質(zhì)有關(guān)。該藥治療痛風(fēng)的臨床研究結(jié)果顯示，在控制患者關(guān)節(jié)疼痛，肝腎功能，白細(xì)胞，紅細(xì)胞沉降率、C反應(yīng)蛋白方面，與秋水仙堿組無顯著性差異，證明了清熱養(yǎng)陰除濕丸具有較好地控制關(guān)節(jié)炎癥的作用[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，清熱養(yǎng)陰除濕丸各劑量組相較模型組，關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)腫脹積分均較低，而與秋水仙堿組相當(dāng)，炎癥介質(zhì)白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-18、腫瘤壞死因子-α的含量低于模型組，高劑量組與秋水仙堿組相當(dāng)；在調(diào)節(jié)NEK7/GSDMD通路上，與秋水仙堿組比較，高劑量組對(duì)該通路各相關(guān)蛋白的表達(dá)具有明顯的抑制作用。從結(jié)果來看，清熱養(yǎng)陰除濕丸對(duì)炎癥通路的影響呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著劑量的增加，抗炎作用更明顯，這與臨床應(yīng)用中觀察結(jié)果相類似。

綜上所述，本研究證明清熱養(yǎng)陰除濕丸能夠抑制NEK7-NLPR3炎癥小體的形成，降低GSDMD的產(chǎn)生，調(diào)控細(xì)胞焦亡的發(fā)生，減少炎癥介質(zhì)表達(dá)，從而減輕關(guān)節(jié)炎癥。清熱養(yǎng)陰除濕丸的抗炎作用可能是通過NEK7/GSDMD通路實(shí)現(xiàn)的，這為進(jìn)一步深入研究該藥的作用機(jī)制提供前期基礎(chǔ)，為清熱養(yǎng)陰除濕丸治療痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎提供生物學(xué)依據(jù)。