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      灌漿期小麥旗葉在高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組分析

      2022-11-17 05:59:02劉秀坤韓冉李曉明解樹斌李法計(jì)陳亞鵬翟勝男李豪圣劉建軍趙振東張玉梅曹新有
      山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年10期
      關(guān)鍵詞:差異基因測序高溫

      劉秀坤,韓冉,李曉明,解樹斌,李法計(jì),陳亞鵬,翟勝男,李豪圣,劉建軍,趙振東,張玉梅,曹新有

      (1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山東 青島 266109;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/小麥玉米國家工程中心/農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東省小麥技術(shù)創(chuàng)新中心,山東 濟(jì)南 250100;3.山東魯研農(nóng)業(yè)良種有限公司,山東 濟(jì)南 250100;4.滕州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,山東 滕州 277599)

      小麥?zhǔn)俏覈诙蠹Z食作物[1],2010—2019年平均種植面積在2400萬公頃左右。小麥具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和特殊的面筋特性,可用于多種食品的加工,為人類提供21%的食物熱量和20%的蛋白質(zhì)[2]。

      小麥?zhǔn)窍矝鲎魑?,日均?0~24℃最適合其籽粒灌漿,超過30℃會對籽粒灌漿和品質(zhì)造成影響[3]。研究表明,灌漿期高溫天氣頻發(fā)會使小麥灌漿速率降低[4],灌漿時(shí)間縮短[5],造成小麥籽粒灌漿不充分,降低小麥產(chǎn)量;全球氣溫每上升1℃,小麥減產(chǎn)6%[6]。根據(jù)濟(jì)南市氣象局的溫度記錄,2017—2021年間小麥灌漿期日均溫在27~30℃,最高可達(dá)35℃,這不僅會降低小麥產(chǎn)量,還會對小麥品質(zhì)造成影響[7]。麥谷蛋白含量與醇溶蛋白含量的比值影響小麥的面筋特性,灌漿中后期高溫,麥谷蛋白含量降低,醇溶蛋白含量增加,使麥谷蛋白含量與醇溶蛋白含量比值減小,降低面筋強(qiáng)度[8]。與此同時(shí),灌漿期溫度超過30℃,會使小麥淀粉含量降低,面團(tuán)強(qiáng)度下降,影響其加工品質(zhì)[9]。

      植物在生長發(fā)育過程中往往會遭受諸多非生物因素脅迫,如鹽堿、低溫、干旱、高溫等,這些非生物脅迫會使代謝過程紊亂,致使細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)積累,影響植物正常的生長發(fā)育[10]。目前,植物抵御高溫脅迫的機(jī)理研究已取得了較大進(jìn)展,與耐熱相關(guān)的基因也在陸續(xù)挖掘和驗(yàn)證。田雪軍在小麥中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)耐熱基因——TaMBF1c和TaMYB85,熱脅迫條件下,TaMBF1c的缺失突變體在微管運(yùn)輸、脅迫響應(yīng)、蛋白質(zhì)加工代謝等途徑中相關(guān)基因的翻譯效率降低,而過表達(dá)TaMBY85基因的擬南芥和小麥耐熱性提高[11]。高溫脅迫會促進(jìn)植物體熱激蛋白(heat shock protein)的轉(zhuǎn)錄和翻譯,而熱激蛋白具有維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和正常生理功能的作用。Montero-Barrientos等研究表明,轉(zhuǎn)哈氏芽孢桿菌hsp70基因的擬南芥表現(xiàn)出了更高的耐熱性,且植株生長并沒有受到抑制,在經(jīng)過高溫預(yù)處理后表現(xiàn)出了更好的抵御逆境脅迫的能力[12]。Katiyar-Agarwal等將擬南芥基因Athsp101導(dǎo)入水稻中,轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出更高的耐熱能力,高溫脅迫后產(chǎn)量沒有顯著下降[13]。在受到熱脅迫后,小麥熱激轉(zhuǎn)錄因子TaHsfA1能促進(jìn)熱激蛋白的表達(dá),提高擬南芥幼苗的耐熱性[14]。因此,明晰耐熱調(diào)控網(wǎng)絡(luò),挖掘耐熱相關(guān)基因,利用分子育種等手段選育耐熱品種,對提高小麥耐熱性具有重要意義。

      本試驗(yàn)以本課題組前期研究中篩選到的小麥耐熱品種菏麥13和熱敏感品種臨麥2號[15]為試材,經(jīng)熱脅迫處理,運(yùn)用RNA-seq技術(shù)對灌漿期旗葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,以挖掘熱脅迫相關(guān)基因,為后續(xù)進(jìn)一步研究耐熱脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、選育耐熱新品種奠定基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)材料

      本研究選用耐熱品種菏麥13和熱敏感品種臨麥2號為材料,于2018年10月中旬正常播種于埋置在大田的花盆中,每盆10粒,按大田常規(guī)管理,待出苗后間苗,每盆留5株。每份材料種4盆。

      1.2 樣品處理及分類

      花后14 d,將4盆材料(2盆菏麥13和2盆臨麥2號)移至人工氣候箱,42℃處理0、1 h,剩余4盆留至原處作為對照。取主穗同等部位的旗葉于-80℃冰箱保存。所取樣品按照以下方案進(jìn)行分類,用于后續(xù)的RNA-seq及分析。

      表1 樣品分類及差異分析對比方案

      1.3 文庫構(gòu)建及測序

      提取樣品總RNA并使用DNaseⅠ消化DNA后,用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA,向得到的mRNA中加入適量打斷試劑,高溫條件下使其片斷化,再以片斷后的mRNA為模板,合成cDNA,經(jīng)過磁珠純化、末端修復(fù)、3′末端加堿基A、加測序接頭后,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從而完成整個(gè)文庫制備工作。構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System進(jìn)行質(zhì)量和產(chǎn)量檢測,文庫質(zhì)控合格后進(jìn)行測序。

      1.4 原始數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計(jì)及質(zhì)量分析

      應(yīng)用base calling將測序得到的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成序列信息,為了保證信息分析的可靠性,需對數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列的處理:去除含adapter的reads,去除含N比例大于10%的reads,去除低質(zhì)量的reads(從整體上,Q≤20的堿基比例較低表明測序質(zhì)量較好),從而獲得clean reads。

      1.5 差異基因的篩選

      基于泊松分布分析方法,通過控制FDR(錯(cuò)誤發(fā)生率),根據(jù)表達(dá)量(FPKM值)計(jì)算基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù),以FDR≤0.001、≥2為標(biāo)準(zhǔn)篩選兩樣本間的差異基因。

      1.6 轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜qRT-PCR驗(yàn)證

      為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性,需要對差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。我們隨機(jī)選取了20個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。利用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表2)。

      表2 qRT-PCR引物

      2 結(jié)果與分析

      2.1 測序質(zhì)量分析

      從整體上看,樣本的CG含量在53.34%~55.08%之間,Q20比例在98.95%以上,Q30比例在96.26%以上(表3)。說明樣本的質(zhì)量較好,可用于下一步分析。

      表3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

      2.2 差異基因的篩選結(jié)果

      最終4個(gè)對比方案共獲得4715個(gè)差異基因(圖1)。臨麥2號葉片0 h-vs-臨麥2號葉片1 h檢測出1527個(gè)差異表達(dá)基因,菏麥13葉片0 h-vs-菏麥13葉片1 h檢測出1190個(gè)差異表達(dá)基因,說明小麥旗葉中某些基因?qū)Ω邷孛{迫做出響應(yīng),在高溫條件下表達(dá)。臨麥2號葉片0 h-vs-菏麥13葉片0 h檢測到1225個(gè)差異表達(dá)基因,臨麥2號葉片1 hvs-菏麥13葉片1 h檢測到773個(gè)差異表達(dá)基因,說明在高溫脅迫下某些基因會沉默,不表達(dá)。

      圖1 樣品差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)

      2.3 轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜qRT-PCR驗(yàn)證

      隨機(jī)選擇20個(gè)耐熱基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證(圖2),其中11個(gè)上調(diào)表達(dá),如與逆境脅迫相關(guān)基因Rps7和Snf1、熱脅迫相關(guān)基因MADS等;9個(gè)下調(diào)表達(dá),如氧化脅迫相關(guān)基因Beta-carotene hydroxylase、核小體蛋白亞基H2B等。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果表明表達(dá)趨勢與RNA-seq測序分析結(jié)果一致,證明了RNA-seq測序結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性,也為下一步確定候選基因并進(jìn)行深入研究提供了參考。

      圖2 差異基因的qRT-PCR驗(yàn)證

      2.4 差異基因GO顯著富集分析

      將獲得的目的基因進(jìn)行GO富集分析,主要從基因的分子功能(molecular function)、所處的細(xì)胞位置(cellular component)、參與的生物過程(biological process)三部分分析差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能(圖3)。4個(gè)對比方案中,生物過程主要富集在代謝過程、細(xì)胞過程、單體過程、定位和刺激反應(yīng),細(xì)胞組分部分主要富集在細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器、細(xì)胞器組分、膜、膜組分和高分子復(fù)合物,分子功能部分主要富集在結(jié)合物和催化活性。

      圖3 差異基因GO功能富集分析

      2.5 差異表達(dá)基因的KEGG注釋及通路分析

      通過對差異表達(dá)基因的通路注釋可以進(jìn)一步解釋基因的生物學(xué)功能,對4715個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG分析,選取顯著富集的前20個(gè)通路繪制散點(diǎn)圖(圖4)。臨麥2號葉片0 h-vs-臨麥2號葉片1 h之間差異顯著富集的通路主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、氧化磷酸化、內(nèi)吞作用、剪接體、核糖體、光合作用、氮代謝、谷胱甘肽代謝,臨麥2號葉片0 h-vs-菏麥13葉片0 h之間差異顯著富集的通路主要在谷胱甘肽代謝、苯并惡嗪酮類化合物生物合成、二羧酸代謝、檸檬烯和蒎烯降解、維生素B6代謝、油菜素內(nèi)酯的生物合成、二苯酚、二甲苯和姜二醇生物合成、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、異黃酮的生物合成、亞麻酸代謝、甘油磷脂代謝、苯丙素的生物合成、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、色氨酸代謝,臨麥2號葉片1 h-vs-菏麥13葉片1 h之間顯著富集的通路主要在代謝途徑、光合作用、氧化磷酸化、二羧酸代謝、谷胱甘肽代謝、亞麻酸代謝、油菜素內(nèi)酯的生物合成,菏麥13葉片0 h-vs-菏麥13葉片1 h之間差異顯著富集的通路主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、內(nèi)吞作用、剪接體、異黃酮生物合成、光合作用、氧化磷酸化、檸檬烯和蒎烯降解、二萜生物合成、核苷酸切除修復(fù)、亞油酸代謝、錯(cuò)配修復(fù)、DNA復(fù)制。

      圖4 差異基因KEGG富集通路

      2.6 差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄因子

      對所有差異表達(dá)基因歸類,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子共有86個(gè)(表4),屬于21個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族,主要包含AP2-EREBP家族15個(gè)(上調(diào)10個(gè),下調(diào)5個(gè)),MYB家族11個(gè)(上調(diào)4個(gè),下調(diào)7個(gè)),NAC家族8個(gè)(上調(diào)4個(gè),下調(diào)4個(gè)),WRKY家族12個(gè)(上調(diào)5個(gè),下調(diào)7個(gè)),HSF家族7個(gè)(上調(diào)7個(gè))。

      表4 差異表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目統(tǒng)計(jì)

      3 討論與結(jié)論

      植物對高溫的響應(yīng)是多基因控制的過程,為了明確小麥在全基因組水平上對高溫的響應(yīng)機(jī)制,本研究采用高通量測序技術(shù),對耐高溫小麥品種菏麥13和熱敏感品種臨麥2號在花后14 d 42℃高溫處理0、1 h,取旗葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析,Q30比例在96%以上,表明測序質(zhì)量良好,保證了數(shù)據(jù)的可靠性,可以進(jìn)行后續(xù)分析。本研究共篩選出4715個(gè)差異表達(dá)基因,其中上調(diào)表達(dá)基因數(shù)目為3040個(gè),下調(diào)表達(dá)基因數(shù)目為1675個(gè)。

      3.1 不同品種在熱脅迫下差異基因的GO分析

      通過差異表達(dá)基因的GO富集分析可知,4個(gè)比較方案在參與的生物過程和所處細(xì)胞位置方面主要富集在代謝過程和細(xì)胞。在高溫處理1 h后,臨麥2號葉片0 h-vs-臨麥2號葉片1 h、菏麥13葉片0 h-vs-菏麥13葉片1 h中刺激反應(yīng)富集的基因數(shù)目明顯較臨麥2號葉片0 h-vs-菏麥13葉片0 h多,說明某些基因在高溫條件下開始表達(dá),對逆境做出響應(yīng)。在分子功能方面,臨麥2號葉片0 h-vs-臨麥2號葉片1 h和菏麥13葉片0 h-vs-菏麥13葉片1 h結(jié)合物富集基因較多,臨麥2號葉片0 h-vs-菏麥13葉片0 h和臨麥2號葉片1 h-vs-菏麥13葉片1 h則是催化活性富集較多,表明高溫脅迫下,基因以結(jié)合物的形式參與調(diào)控。臨麥2號葉片1 h-vs-菏麥13葉片1 h在膜上富集的基因數(shù)目較臨麥2號葉片0 h-vs-臨麥2號葉片1 h少了許多,這可能是耐熱品種與不耐熱品種之間的差異。

      3.2 不同品種在熱脅迫下差異基因的KEGG分析

      在KEGG 4種比較方案的分析中,臨麥2號葉片0 h-vs-臨麥2號葉片1 h和菏麥13葉片0 h-vs-菏麥13葉片1 h的差異基因顯著富集的通路主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、內(nèi)吞、光合作用、谷胱甘肽代謝、剪接體等方面。光合作用發(fā)生次數(shù)最多,表明高溫對光合作用的影響最大。光合速率的降低會阻礙同化物的運(yùn)輸,降低淀粉合成速率,導(dǎo)致小麥籽粒干癟,千粒重減少,從而影響產(chǎn)量[1]。當(dāng)高溫脅迫發(fā)生時(shí),植物的耐高溫機(jī)制開始響應(yīng),如熱激蛋白和熱激轉(zhuǎn)錄因子開始參與高溫脅迫,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工得到加強(qiáng)。內(nèi)吞作用是鈣離子進(jìn)入細(xì)胞的途徑之一,鈣離子在抵抗高溫脅迫方面也起著重要作用。有研究表明,在小麥葉片上噴灑一定濃度的CaCl2溶液可以有效提高小麥的耐熱性,提高小麥產(chǎn)量[17]。谷胱甘肽參與誘導(dǎo)多種熱激蛋白的表達(dá),例如谷胱甘肽通過轉(zhuǎn)錄因子MYB21激活熱休克蛋白基因bip3和hsp70b啟動子,通過轉(zhuǎn)錄因子BZIP10激活hsp90.1啟動子[18,19]。

      3.3 部分轉(zhuǎn)錄因子對熱脅迫的響應(yīng)

      轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞響應(yīng)外界脅迫以后主要調(diào)控某些基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子。朱丹等[20]以薄荷為試驗(yàn)材料,在光照培養(yǎng)箱設(shè)置40℃模擬高溫脅迫處理2 h,采集葉片進(jìn)行高通量測序,其結(jié)果顯示與高溫脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族主要集中在NAC、AP2-EREBP、WRKY、MYB、HSF等轉(zhuǎn)錄因子家族;張春霄[21]在黃花苜蓿中克隆到AP2/EREBP家族的MfERF049基因,對該基因進(jìn)行了高溫、低溫、干旱、耐鹽等非生物脅迫且該基因?qū)ι鲜龇巧锩{迫做出響應(yīng)。李靜宇等[22]證實(shí)MYB基因上啟動子區(qū)域含有多種脅迫和生物激素的響應(yīng)元件。NAC轉(zhuǎn)錄因子家族在調(diào)控包含高溫在內(nèi)的多種非生物脅迫時(shí)起到了非常重要的作用[23,24]。WRKY是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族,具有一個(gè)或兩個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域[25],與種子的休眠和萌發(fā)、作物的衰老和抵御逆境脅迫有關(guān)。HSF轉(zhuǎn)錄因子家族在對高溫的響應(yīng)中一直發(fā)揮著重要作用[26,27]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高溫脅迫下,小麥旗葉中的轉(zhuǎn)錄因子包括NAC、AP2-EREBP、WRKY、MYB、HSF。這與前人結(jié)果一致,表明這些轉(zhuǎn)錄因子在小麥應(yīng)對高溫脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。該結(jié)果為后續(xù)探索小麥高溫脅迫的分子機(jī)制及選育優(yōu)質(zhì)的耐高溫品種提供理論依據(jù)。

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