基于SNP 芯片對里岔黑豬進(jìn)行遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析的研究

李 曉，崔 超，王 源，于光輝*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.膠州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東青島 266300）

里岔黑豬是膠州市里岔鎮(zhèn)群眾四千年選育逐步形成的具有特色的、極為罕見的優(yōu)良地方豬種，是山東省的重要地方品種豬[1-2]，其毛色全黑，嘴筒長直，額有縱紋，具有耐粗飼、適應(yīng)能力強(qiáng)、繁殖性能好等特色，椎骨數(shù)較其他豬種多1～2 節(jié)，是我國優(yōu)良的地方品種，素有“南太湖，北里岔”之稱[3]。

自上世紀(jì)以來，國內(nèi)引種熱潮高漲，大量國外豬種（長白、大白、杜洛克等）被引入，由于引入豬種具有瘦肉率高、生長周期短等特點(diǎn)[4]，對中國地方豬造成較大沖擊，且部分地方豬種被盲目雜交或者被淘汰，導(dǎo)致血統(tǒng)不純和群體規(guī)模銳減[5]，進(jìn)行種質(zhì)資源保護(hù)顯得尤為重要。

以人工記錄系譜的方式進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，會因記錄錯誤等原因，影響最終選種育種效果。通過分子水平進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析能夠精準(zhǔn)了解里岔黑豬群體現(xiàn)狀，對地方豬種保護(hù)和利用具有重要意義[6]。隨著保種技術(shù)的不斷發(fā)展，通過SNP 芯片保種逐漸成為主流[7-8]。SNP 芯片作為現(xiàn)階段重要的育種工具之一，被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，其工作原理是通過芯片上固定的DNA序列與目的基因發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，繼而進(jìn)行序列中的SNP 位點(diǎn)鑒定[9-11]。本實驗利用SNP 芯片對茂華里岔黑豬良種場的在繁群體進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性分析，為里岔黑豬的選育及品種利用率提高等方面提供分子水平的參考依據(jù)。目前對里岔黑豬群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究處于一個相對初級階段，通過系統(tǒng)評價該群體有利于更好地保護(hù)該遺傳資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選擇膠州市茂華里岔黑豬良種場共109頭能繁里岔黑豬為研究對象，其中公豬13 頭、母豬96 頭，采集其耳組織置于含無水乙醇的離心管中帶回實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA 提取與基因分型 采用酚-氯仿抽提法提取耳組織DNA，經(jīng)紫外分光光度儀和凝膠電泳對DNA 質(zhì)量進(jìn)行檢測，檢測合格后的DNA 樣本使用“中芯一號”芯片（北京康普森農(nóng)業(yè)科技有限公司）進(jìn)行SNP 基因分型，然后利用Plink（V1.90）軟件[12]對基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，保留常染色體上的位點(diǎn)，剔除最小等位基因頻率小于0.01 的位點(diǎn)，質(zhì)控后剩余39 644 個SNP 位點(diǎn)。

1.2.2 親緣關(guān)系分析 將Plink（V1.90）軟件質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析并計算個體間的親緣關(guān)系[13]，采用Origin 2021 軟件繪制第一主成分與第二主成分的二維圖，分析品種內(nèi)的群體結(jié)構(gòu)，使用R 腳本構(gòu)建熱圖。通過G 矩陣（V2）軟件和RStudio 來計算親緣關(guān)系值和熱圖。

1.2.3 群體結(jié)構(gòu)分析 將基因型數(shù)據(jù)質(zhì)控后的39 644 個SNP 位點(diǎn)進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，通過MEGA7.0 軟件[14]構(gòu)建鄰接法進(jìn)化發(fā)育樹（Neighbor-Joining tree,NJ tree）進(jìn)行聚類分析，通過Plink（V1.90）軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。

1.2.4 ROH 分析 ROH 的長度和頻率用來反應(yīng)該群體的歷史，使用Plink（V1.90）軟件分析并統(tǒng)計每個樣本中ROH 長度、分布和數(shù)目，利用公式計算ROH 片段總長度與常染色體基因總長度比值，得到基于ROH 的近交系數(shù)[15]。

其中，k 是個體的ROH 數(shù)目，L 是該物種的常染色體基因組的長度（豬V10.2 版本的基因組，常染色體長度約為2 450 462.292 kb）。

2 結(jié)果與分析

2.1 里岔黑豬遺傳多樣性分析 為了探究現(xiàn)存里岔黑豬群體的遺傳結(jié)構(gòu)，將測得的里岔黑豬芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)膠州市茂華里岔黑豬良種場中里岔黑豬的有效群體含量為5.88，多態(tài)性遺傳標(biāo)記為0.825，期望雜合度為0.346 8，觀察雜合度為0.334 9；里岔黑豬群體的觀察雜合度小于期望雜合度，可能是群體內(nèi)近交造成的。

2.2 種群親緣關(guān)系分析 本實驗將109 個樣本的39 644個SNP 進(jìn)行主成分分析。由圖1 可知，膠州市茂華里岔黑豬良種場所有能繁豬之間親緣關(guān)系適中，多樣性相對較高。但在第一主成分中，右側(cè)的個體之間親緣關(guān)系比較緊密，表明親緣關(guān)系較近，可能存在近交。進(jìn)而構(gòu)建了該群體的G 矩陣（圖2），也驗證了主成分分析的結(jié)果，大部分樣本處于中等親緣關(guān)系范圍，部分樣本間親緣關(guān)系較近，表明存在一定的近親繁殖趨勢，配種計劃中應(yīng)避免該樣本相遇。

圖1 里岔黑豬主成分分析結(jié)果

圖2 里岔黑豬基于G 矩陣的基因組親緣關(guān)系分析

2.3 里岔黑豬群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 本實驗所用里岔黑豬的血統(tǒng)信息均是由公豬得來，將13 頭公豬結(jié)合G 矩陣和聚類分析。結(jié)果顯示，現(xiàn)存公豬被分為8 個家系（圖3），自上而下每個家系分別有1、1、1、2、1、2、2、3 頭公豬，具體家系信息見表1。結(jié)合群體中的母豬和公豬的關(guān)系，除了8 個家系外，另有28 頭母豬的血緣關(guān)系與任一公豬的親緣關(guān)系均低，因此將其單獨(dú)分類。

表1 里岔黑豬家系構(gòu)建

圖3 里岔黑豬能繁公豬樣本聚類分析

2.4 近交程度分析 在109 頭里岔黑豬中，共檢測到4 250個ROH 片段，個體ROH 的總長度為0～1 008.33 Mb，平均ROH長度為343.56±18.251Mb，ROH長度在300～450Mb之間的個體數(shù)目最多，占39.45%（圖5）。里岔黑豬個體含有的ROH 數(shù)量為0～70 個，平均為38.99±1.461 個，其中40～50 個ROH 的個體最多，占34.86%（圖6）。通過對群體中各個體的ROH 統(tǒng)計，得到每個個體基于ROH 的近交系數(shù)值，由圖7 可以得出，膠州市茂華里岔黑豬良種場近交系數(shù)主要集中在0.1～0.2 之間，當(dāng)前整個保種群體的平均近交系數(shù)值為0.14。

圖5 里岔黑豬ROH 長度的樣本數(shù)

圖6 里岔黑豬ROH 數(shù)量的樣本數(shù)

圖7 ROH 的近交系數(shù)分布情況

3 討 論

3.1 遺傳多樣性分析 里岔黑豬作為山東省重要的地方豬種之一，其系譜記錄一直采用傳統(tǒng)的人工記錄而后統(tǒng)計匯總的方法，記錄過程中可能會出現(xiàn)錯寫或者漏寫等不確定因素，導(dǎo)致系譜錯誤或者無系譜的結(jié)果。基于SNP 芯片數(shù)據(jù)對里岔黑豬現(xiàn)存群體進(jìn)行整體評估，將芯片數(shù)據(jù)構(gòu)建的家系與記錄系譜相對照，能夠準(zhǔn)確了解里岔黑豬現(xiàn)階段的遺傳多樣性和保種現(xiàn)狀。隨著芯片技術(shù)的開發(fā)，Geneseek[16]、中芯一號、液相50 K[17]等的出現(xiàn)，降低了后續(xù)的育種成本，能夠促進(jìn)我國育種發(fā)展進(jìn)度，從分子層面對其性狀進(jìn)行分析并指導(dǎo)育種。本研究所用里岔黑豬群體處于世代封閉模式，由于后期系譜丟失導(dǎo)致家系不明確，因此均作為同一世代進(jìn)行測序。使用“中芯一號”芯片測得里岔黑豬有效群體含量為5.88，多態(tài)性遺傳位點(diǎn)為0.825，這可能是群體內(nèi)近交導(dǎo)致的結(jié)果，又由于里岔黑豬群體的期望雜合度小于觀察雜合度，這進(jìn)一步佐證了群體內(nèi)近交的現(xiàn)狀。本次測序結(jié)果較已報道的其他中國地方豬種（金華豬等）的有效群體含量略低[18]，且明顯低于商品豬有效群體大小[19]；劉彬等[20]利用“中芯一號”芯片對青峪豬群體進(jìn)行分析，其中有效群體含量最高的為F1世代有12 頭，最低為F3世代僅有3 頭；F1世代多態(tài)性遺傳位點(diǎn)最高為0.659 2，F(xiàn)3世代最低為0.536，發(fā)現(xiàn)3 個重疊世代中多態(tài)性遺傳位點(diǎn)與遺傳多樣性豐富度隨世代均有下降趨勢，這符合中國地方豬種現(xiàn)狀。里岔黑豬雜合度的值低于之前報道的中國其他豬的雜合度[21]，這意味著遺傳變異性相較于以前略有降低。根據(jù)基因芯片結(jié)果分析可得，可以在維持膠州市茂華里岔黑豬良種場現(xiàn)有家系不減少的情況下，制定合理的配種方案，減少近親交配，維持其遺傳多樣性。

3.2 親緣關(guān)系與遺傳結(jié)構(gòu)分析 為了分析茂華里岔黑豬良種場現(xiàn)存群體的遺傳關(guān)系，通過NJ tree 并進(jìn)行聚類分析[22]。整個里岔黑豬群體共109 頭，可以分為8 個公豬的家系和1 個非公豬家系，共有3 個父系起源。目前里岔黑豬群體家系結(jié)構(gòu)可以得出，不同家系公母豬數(shù)量和近交系數(shù)均不平衡，其中有4 個家系公豬數(shù)量最少僅有1 頭，這與蔡春波等[23]利用Illumina CAUPorince 50 K 芯片測得的結(jié)果相似，馬身豬被分成3 個家系，共20 頭種公豬，其中部分母豬同時被分到了幾個家系中并出現(xiàn)交叉現(xiàn)象，各家系公母豬數(shù)差異較大，家系結(jié)構(gòu)不平衡；王晨等[24]采用Illumina CAUPorince 50 K芯片也得出了相似結(jié)果，139 頭藍(lán)塘豬被劃分為4 個公豬家系和1 個非公豬家系，平均每個家系4 頭公豬，但最少的家系僅2 頭公豬，家系結(jié)構(gòu)不平衡。這可能與人工選種時僅按照體況健康、符合地方品種特征、性欲是否旺盛等留種標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，這也符合前期技術(shù)不發(fā)達(dá)時的選種現(xiàn)狀。在后續(xù)保種工作中，各家系需要多加留種，使里岔黑豬群體中各家系血脈維持在一個相對穩(wěn)定的數(shù)量，以防血脈丟失。通過SNP 芯片數(shù)據(jù)檢測出的各公豬家系，可以通過冷凍精液的方式進(jìn)行家系保護(hù)，有效降低保種支出。

3.3 近交程度分析 ROH 通常被用來估計基因組的近交系數(shù)[25]，ROH 長度和ROH 覆蓋的基因組比例可以很好地反映近交系的年齡和來源，從而反映近交的水平。ROH 的長度與個體間親緣成正比，ROH 片段越長其近交可能性越大，反之亦然[26]；ROH 片段數(shù)目越多一般認(rèn)為該群體存在一定的近親繁殖[27]。在本實驗檢測的109 頭里岔黑豬群體中，共檢測到4 250 個ROH 片段，ROH 長度在500 Mb 以下占84.4%，最短ROH 為0 Mb，少部分個體ROH 長度達(dá)到900 Mb 以上，里岔黑豬個體含有的ROH 數(shù)量在40～50 個ROH 的個體最多，最少的僅有1 個ROH，平均近交系數(shù)值為0.14。相較于Liu 等[28]對梁山豬進(jìn)行全基因組分析，得出涼山豬的大多數(shù)（80%）ROH 在100 Mb 以內(nèi)，ROH 平均長度為63.24 Mb，群體的平均近交系數(shù)為0.026，里岔黑豬ROH 長度長于梁山豬，這可能是里岔黑豬在長期交配過程中，無意識的近交導(dǎo)致的結(jié)果，從兩者的平均近交系數(shù)也能反映出近交的情況；Xu 等[29]通過基因組還原和測序技術(shù)（GGRS）進(jìn)行基因分型，202 頭金華豬的ROH 數(shù)量大多數(shù)（77%）由1～5 Mb 的片段構(gòu)成，ROH 長度小于10 Mb 的占總數(shù)的92%。古代與近代祖先對金華豬群體基因組產(chǎn)生了一定的影響，盡管群體內(nèi)大部分個體近交系數(shù)較低，但仍有較高水平的近交系數(shù)，在后續(xù)留種過程中逐步淘汰該種個體，保證其遺傳多樣性；Wang 等[30]利用Illumina 60 K 芯片將江西省的3個地方品種豬在全球豬群中進(jìn)行比較，東鄉(xiāng)花豬的平均ROH 最高達(dá)到140.5 Mb、萍鄉(xiāng)兩頭烏平均ROH 最高達(dá)到38.7 Mb，稍高于野豬（20.6 Mb），玉山黑豬平均ROH 稍高為121.7 Mb。里岔黑豬相比較野豬和中國部分地方豬種（梁山豬、金華豬等）近交系數(shù)相對較大，可能是因為從小群體發(fā)展至如今規(guī)模，一直以本交作為配種方式，所以存在一定劣勢，后期可以通過SNP 數(shù)據(jù)合理安排配種計劃，必要時可以改變配種方式，采用人工授精[31]等方式保證群體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

3.4 制定適合的育種方案 通過分析里岔黑豬NJ 數(shù)據(jù)，從8 個家系中各選1 頭性狀優(yōu)良的種公豬，將96 頭能繁母豬隨機(jī)分為8 組，每組12 頭。參考Windig 等[32]通過計算機(jī)模擬的幾種保種方案，按照輪換交配的方式，制定適合于膠州市茂華里岔黑豬良種場的育種方案：第1 輪按照家系A(chǔ) 與第1 組母豬交配；家系B 與第2 組母豬交配；家系C 與第3 組母豬交配……家系H 與第8 組母豬交配。第2 輪按照家系A(chǔ) 與第2 組母豬交配；家系B 與第3 組母豬交配；家系C 與第4 組母豬交配……家系H 與第1 組母豬交配。第3 輪家系A(chǔ) 與第3 組母豬交配；家系B 與第4 組母豬交配；家系C 與第5 組母豬交配……家系H 與第2 組母豬交配，按照步驟依次輪轉(zhuǎn)交配，能有效減緩近交系數(shù)增長速度。

4 結(jié) 論

本研究從分子水平基于里岔黑豬群體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)里岔黑豬群體遺傳多樣性較豐富；各家系中個體數(shù)相對較少且差異明顯，需注意家系內(nèi)留種；為防止膠州市茂華里岔黑豬良種場群體內(nèi)近交系數(shù)增長過快，需制定合理配種方案，必要時可以從其他保種場引入新鮮血液。