百香果酵素自然發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)物及抗氧化活性研究

蔣家璇，韓盼盼，孔振楊，程陸陸，姚沛琳

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州 234000）

0 引言

食用植物酵素是以新鮮蔬菜、水果、藥食兩用本草類為原料，由多種微生物經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵得到的功能性發(fā)酵產(chǎn)品[1]。據(jù)報(bào)道，食用植物酵素可以有效清除體內(nèi)過(guò)多的活性氧自由基，當(dāng)自由基積累過(guò)多時(shí)，會(huì)對(duì)機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等造成損傷，從而引發(fā)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)被破壞，甚至引發(fā)細(xì)胞突變[2]。在預(yù)防和治療因自由基誘發(fā)的疾病和抗衰老方面具有廣闊的應(yīng)用前景[3-4]。

百香果分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，是一種重要的藥食同源類植物，常作為民間傳統(tǒng)藥材使用[5-6]。百香果中含有的酚類化合物種類和含量較多，如黃酮類、黃酮醇類及酚類、酸類等[7]。百香果由于具有良好的風(fēng)味特征，已在飲料加工中廣泛使用，受到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。但是，目前對(duì)于百香果的加工依然是初級(jí)加工模式，制作成百香果風(fēng)味飲料或果干，因此可以借助酵素這種高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的產(chǎn)品，增加百香果的附加價(jià)值，實(shí)現(xiàn)百香果產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級(jí)[8]。

目前，食用植物酵素品類繁多，發(fā)酵周期長(zhǎng)，品質(zhì)差別較大，而且缺少相關(guān)科學(xué)支撐。因此，亟需對(duì)食用植物酵素發(fā)酵過(guò)程中的重要的代謝產(chǎn)物變化和功能特性進(jìn)行深入研究[9-10]。以百香果為原料，采用自然發(fā)酵方法制備百香果酵素，探究發(fā)酵過(guò)程中總糖、總酸、總酚等活性成分的變化規(guī)律，并以DPPH、羥基和ABTS 自由基清除率及還原力為指標(biāo)，研究體外抗氧化活性的變化規(guī)律，為百香果酵素的精準(zhǔn)發(fā)酵控制提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，用標(biāo)準(zhǔn)化手段規(guī)范傳統(tǒng)工藝，縮短發(fā)酵周期，保證酵素品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮百香果、單晶冰糖，購(gòu)自宿州大潤(rùn)發(fā)超市。

1.1.2 主要試劑

氫氧化鈉、酚酞、蒽酮、濃硫酸、沒(méi)食子酸、福林酚（10%）、碳酸鈉、無(wú)水乙醇、抗壞血酸、過(guò)氧化氫、水楊酸鈉、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵，國(guó)藥集團(tuán)提供；標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液、1,1 -二苯基-2 -三硝基苯肼、ABTS 自由基清除能力檢測(cè)試劑盒，上海源葉生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-400FE 型生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Multiskan Go 酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；1-1SPK 小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Sigma）、pH 計(jì)（希瑪儀表）、BSA124S 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；JRA-6 型數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-1CU 型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；GI100T 型滅菌鍋，致微儀器有限公司產(chǎn)品；玻璃發(fā)酵罐（居元素）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 百香果酵素的制備

用超純水清洗百香果表面雜質(zhì)，自然瀝干水分，將試驗(yàn)器材進(jìn)行滅菌，百香果與糖質(zhì)量比為1∶1，混勻密封，避光室溫發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中，每天同一時(shí)間進(jìn)行放氣15 min、攪拌，觀察發(fā)酵情況。在發(fā)酵的第0 天，第10 天，第20 天，第30 天，第40 天，第50 天，第60 天取樣，將樣品以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心6～8 min，取上清液待測(cè)[11]，于-20 ℃下保存，待測(cè)。

1.3.2 代謝產(chǎn)物的測(cè)定

（1）pH 值測(cè)定。利用pH 計(jì)測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化[12]。

（2）總酸含量測(cè)定。根據(jù)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定方法》[13]。

（3）總糖含量測(cè)定。用蒽酮-硫酸法來(lái)測(cè)定樣品中的總糖含量[14]。

（4）總酚含量測(cè)定。GB/T 31740.2—2015 茶多酚的檢測(cè)方法[15]。

1.3.3 抗氧化活性的測(cè)定

（1）DPPH 自由基清除能力的測(cè)定。參照范金波等人[16]的方法，對(duì)DPPH 自由基清除率進(jìn)行測(cè)定。

（2）羥基自由基清除能力的測(cè)定。采用Fenton法[17]。

（3）ABTS 自由基清除能力的測(cè)定。采用ABTS自由基清除能力試劑盒，按照試劑盒提供的方法進(jìn)行測(cè)定。

（4）還原力的測(cè)定。還原力測(cè)定以維C 作為參照[18]，先加入1 mL 不同濃度的樣品液和pH 值為6.6的0.2 moL/L 的磷酸鹽緩沖液2.5 mL，再加入1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合均勻。于50 ℃恒溫反應(yīng)20 min，隨后加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL 終止反應(yīng)，對(duì)停止反應(yīng)的溶液進(jìn)行離心處理。取2.5 mL 離心上清液、2.5 mL 超純水、0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL混合均勻，室溫靜置反應(yīng)10 min，于波長(zhǎng)700 nm 處測(cè)其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 百香果發(fā)酵過(guò)程中pH 值與總酸含量的變化結(jié)果

百香果酵素不同發(fā)酵時(shí)間總酸、pH 值的變化見圖1。

圖1 百香果酵素不同發(fā)酵時(shí)間總酸、pH 值的變化

由圖1 可知，在發(fā)酵前10 d，總酸含量變化不明顯，pH 值迅速下降；當(dāng)發(fā)酵10～20 d 時(shí)，總酸呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，pH 值呈緩慢降低的現(xiàn)象，主要因?yàn)樽匀话l(fā)酵下乳酸菌、醋酸菌等微生物大量增殖，產(chǎn)生大量的酸性次級(jí)代謝產(chǎn)物；在發(fā)酵20～60 d，總酸含量逐漸上升，pH 值基本穩(wěn)定。

2.2 百香果發(fā)酵過(guò)程中總糖含量的變化結(jié)果

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

由圖2 可知，采用蒽酮-硫酸法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為R2=0.998 7，在葡萄糖質(zhì)量濃度為20～160 μg/mL，質(zhì)量濃度和吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

百香果酵素不同發(fā)酵時(shí)間總糖含量的變化見圖3。

圖3 百香果酵素不同發(fā)酵時(shí)間總糖含量的變化

由圖3 可知，發(fā)酵前期（0～20 d），總糖含量迅速降低，一方面說(shuō)明糖作為碳源被分解利用，微生物生長(zhǎng)和代謝較快；另一方面說(shuō)明百香果原料中的水分在高糖滲透壓條件下，發(fā)酵液被稀釋，導(dǎo)致總糖含量降低。發(fā)酵中期（20～40 d），總糖質(zhì)量濃度從0.770 g/mL 下降到0.704 g/mL。發(fā)酵后期（40～60 d），總糖質(zhì)量濃度處于先增加后降低最終趨于穩(wěn)定的階段，增加的原因可能是隨著發(fā)酵液中糖質(zhì)量濃度的降低，微生物開始利用代謝產(chǎn)物中的糖類，進(jìn)而溶解在發(fā)酵液中。

2.3 百香果發(fā)酵過(guò)程中總酚質(zhì)量濃度的變化結(jié)果

總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4，百香果酵素不同發(fā)酵時(shí)間總酚質(zhì)量濃度的變化見圖5。

圖4 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖4 可知，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 5，在沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度10～60 μg/mL，質(zhì)量濃度和吸光度呈良好的線性關(guān)系。由圖5 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚質(zhì)量濃度呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。在發(fā)酵50～60 d 時(shí)總酚含量迅速上升，可能是因?yàn)榘傧愎械姆宇愇镔|(zhì)在此發(fā)酵階段大量溶出，或者是因?yàn)槲⑸锵脑现械哪承┏煞趾铣煞宇愇镔|(zhì)或者其他代謝物轉(zhuǎn)化成酚類物質(zhì)。在發(fā)酵第60 天時(shí)，達(dá)到最高值為0.9 mg/mL。

圖5 百香果酵素不同發(fā)酵時(shí)間總酚質(zhì)量濃度的變化

2.4 抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH 自由基清除能力變化結(jié)果

百香果酵素不同發(fā)酵時(shí)間DPPH 自由基清除率的變化見圖6。

圖6 百香果酵素不同發(fā)酵時(shí)間DPPH 自由基清除率的變化

由圖6 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間增加，0.5%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和1.0%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)DPPH 自由基的清除率的變化趨勢(shì)相同，均呈現(xiàn)先增加再緩慢降低再增加的變化趨勢(shì)。在發(fā)酵第50 天～第60 天時(shí)，DPPH 自由基的清除率呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，可能與此階段總酚的大量增加有關(guān)。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，在發(fā)酵的第30 天，清除率達(dá)到最大值為60.0%；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，在發(fā)酵的第40 天，清除率達(dá)到最大值為78.7%。因此，從DPPH 自由基清除率的變化趨勢(shì)來(lái)看，百香果酵素發(fā)酵時(shí)間在30～40 d 為宜。

2.4.2 羥基自由基清除能力變化結(jié)果

百香果酵素不同發(fā)酵時(shí)間羥基自由基清除率的變化見圖7。

圖7 百香果酵素不同發(fā)酵時(shí)間羥基自由基清除率的變化

采用硫酸亞鐵-過(guò)氧化氫體系產(chǎn)生羥基自由基，通過(guò)水楊酸鈉對(duì)反應(yīng)后的羥基自由基進(jìn)行快速捕捉[20]。由圖7 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，羥基自由基的清除率先增大后穩(wěn)定。在發(fā)酵10～20 d，從37.5%增大到75.1%。在第20 天～第50 天時(shí)，呈緩慢上升然后趨于穩(wěn)定。在第50 天～第60 天時(shí)，呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，可能與微生物衰亡有關(guān)。因此達(dá)到某個(gè)節(jié)點(diǎn)后，延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間對(duì)羥基自由基的清除能力貢獻(xiàn)不大。

2.4.3 ABTS 自由基清除能力變化結(jié)果

百香果酵素不同發(fā)酵時(shí)間ABTS 自由基清除率的變化見圖8。

圖8 百香果酵素不同發(fā)酵時(shí)間ABTS 自由基清除率的變化

由圖8 可知，百香果酵素的ABTS 自由基清除能率保持在35%左右。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，基本上呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在發(fā)酵第50 天，達(dá)到最大值為39.5%。

2.4.4 百香果發(fā)酵過(guò)程中還原力的變化

百香果酵素在不同發(fā)酵時(shí)間還原力的變化見圖9。

圖9 百香果酵素在不同發(fā)酵時(shí)間還原力的變化

由圖9 可知，在整個(gè)發(fā)酵周期，除發(fā)酵20～30 d，均呈現(xiàn)不斷增大的趨勢(shì)。在發(fā)酵40～60 d，增加幅度明顯，吸光度從0.391 上升到0.565。與以上3 種抗氧化指標(biāo)相比，還原力的變化趨勢(shì)與其差別較大，是因?yàn)檫€原力是一個(gè)綜合性指標(biāo)，與多種抗氧化機(jī)制有關(guān)。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)百香果酵素發(fā)酵過(guò)程中總酸、pH 值、總糖、總酚及4 個(gè)抗氧化指標(biāo)的結(jié)果分析來(lái)看，百香果酵素的發(fā)酵可以分為3 個(gè)階段：發(fā)酵初期（0～10 d），發(fā)酵中期（10～20 d），發(fā)酵末期（20～40 d）。因此，在發(fā)酵40 d 時(shí)，可以作為百香果酵素前發(fā)酵結(jié)束的依據(jù)，在該階段，可以通過(guò)補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或者人工接種發(fā)酵微生物進(jìn)行發(fā)酵調(diào)控。采用傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)制備百香果酵素，研究了主要代謝產(chǎn)物及抗氧化活性隨著發(fā)酵時(shí)間的變化趨勢(shì)，有必要開展代謝產(chǎn)物與抗氧化活性相關(guān)性分析及菌群的結(jié)構(gòu)和變化，為百香果酵素精準(zhǔn)發(fā)酵奠定理論基礎(chǔ)。