新疆紅棗中總黃酮的提取及抗氧化活性研究

朱焱超，涂世偉，于夢瑤， 張春蘭，2

（1.塔里木大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300）

紅棗（Ziziphus jujube Mill.）又稱中華大棗、華棗，可藥食兩用，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值，有補(bǔ)胃健脾、補(bǔ)血益氣、潤肺止咳、鎮(zhèn)靜安眠、減輕毒性、提高免疫力等功效[1]。

紅棗中富含黃酮、皂苷、色素、各種維生素和抗氧化酶等活性成分[2-5]。其中，黃酮類化合物具有多種生物保健功能，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗血管增生和抗病毒等作用[6]。黃酮類化合物難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑和稀堿溶液，提取黃酮的工藝包括溶劑提取法[7]、超臨界提取法[8]、微波輔助提取法[9]、堿溶酸沉法[10]、超聲輔助提取法[11]等。因此，紅棗黃酮的提取可提高農(nóng)副產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)效益，對紅棗資源的綜合利用具有重要意義。

采用超聲輔助乙醇溶液提取紅棗中的黃酮類化合物，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度4 個(gè)因素為影響提取的條件，研究紅棗中黃酮類化合物體外抗氧化活性，為新疆紅棗資源進(jìn)一步開發(fā)和利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

駿棗，市售；蘆丁（98%）、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、DPPH（1,1 -二苯基-2 -三硝基苯肼）、Tris（三羥甲基氨基甲烷）等，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TGL-20B 型高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；J6 型紫外可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品；RE-3000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；Biolog ELx808TM 型多功能酶標(biāo)儀，Biotek Instruments 公司產(chǎn)品；Lab-1C-80 型真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

紅棗，清洗、去核，于55 ℃下烘干，粉碎后60 目過篩，4 ℃下冷藏保存。稱取適量紅棗粉，根據(jù)單因素試驗(yàn)提取紅棗中黃酮類化合物，提取液以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，收集上清液濃縮冷凍干燥，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，取0，1，2，3，4，5 mL 置于25 mL 容量瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液1 mL，混勻靜置6 min；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al（NO3）3溶液1 mL，混勻靜置6 min；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH 溶液10 mL，體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液定容，混勻靜置15 min，于波長510 nm 處測定吸光度[12]。以蘆丁溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=10.814X+0.006 8，R2=0.999 6。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別以乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，50%，60%，70%，80%；料液比（g∶mL）1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30；超聲時(shí)間10，20，30，40，50 min；超聲溫度30，40，50，60，70 ℃作為條件提取黃酮類化合物，于波長510 nm 處測定提取液吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中黃酮類化合物質(zhì)量濃度，每組試驗(yàn)平行3 次，求平均值。

1.2.4 總黃酮含量測定

將提取液稀釋后，于波長510 nm 處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程計(jì)算樣品中黃酮含量。

式中：C——稀釋后黃酮提取液的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——提取液體體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)；

W——樣品質(zhì)量，g。

1.2.5 DPPH 自由基清除能力的測定

配制濃度為0.1 mmol/L 的DPPH 溶液，避光30 min；總黃酮提取液凍干，配制質(zhì)量濃度分別為2，4，6，8，10 mg/mL 的黃酮提取液。

取不同質(zhì)量濃度黃酮提取液與DPPH 溶液按1∶3的比例混合，避光30 min，于波長517 nm 處測定其吸光度A1；測定不同質(zhì)量濃度黃酮提取液與無水乙醇混合液的吸光度A2，DPPH 溶液與無水乙醇混合液的吸光度A0[13]。按公式（2）計(jì)算DPPH 自由基清除率。

1.2.6 羥自由基清除能力的測定

取1 mL 不同質(zhì)量濃度黃酮提取液，按順序加入濃度為0.006 mol/L 的FeSO4溶液1 mL、0.006 mol/L的H2O2溶液1 mL、0.006 mol/L 水楊酸-乙醇溶液1 mL，混勻后，37 ℃下水浴30 min，于波長510 nm處測定吸光度A1；其他操作條件不變，用去離子水替換H2O2溶液，于波長510 nm 處測定吸光度A2；其他操作條件不變，用去離子水替換黃酮提取液，于波長510 nm 處測定吸光度A0[4]。按公式（3）計(jì)算羥自由基清除率。

1.2.7 超氧陰離子清除能力的測定

配制pH 值8.2，濃度0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液、0.005 mol/L 鄰苯三酚溶液、10 mol/L HCl 溶液。分別取Tris-HCl 緩沖溶液5 mL，在25 ℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱15 min，按順序加入不同質(zhì)量濃度黃酮提取液2 mL、鄰苯三酚溶液1 mL，混合搖勻，在25 ℃下水浴8 min，加入2 滴HCl 溶液終止反應(yīng)，以去離子水做參比溶液，于波長320 nm 處測定吸光度A1；其他操作條件不變，用去離子水替換鄰苯三酚溶液，于波長320 nm 處測定吸光度A2；其他操作條件不變，用去離子水替換黃酮提取液，于波長320 nm 處測定吸光度A0[14]。按公式（4）計(jì)算超氧陰離子清除率。

1.2.8 Fe2+還原能力的測定

配制pH 值6.6，0.2 mol/L 磷酸緩沖液、1%鐵氰化鉀溶液、10%三氯乙酸溶液、1%三氯化鐵溶液。取不同質(zhì)量濃度黃酮提取液1 mL，按順序加入磷酸緩沖液1 mL、鐵氰化鉀溶液1 mL，50 ℃下水浴20 min后，加入三氯乙酸溶液1 mL，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心10 min，取上清液1 mL，加入去離子水1 mL、三氯化鐵溶液0.2 mL，混勻放置10 min，于波長700 nm處測定吸光度，以空白試劑作為參比液，吸光度越大，則說明對Fe2+的還原能力越強(qiáng)。

1.2.9 ABTS 自由基清除能力的測定

別呦呦是個(gè)很怪的人。她心情好的時(shí)候，像水一樣，能把我融化了，心情不好的時(shí)候，就發(fā)火，無緣無故地發(fā)火。問她為什么這樣？她說，我沒靈感，一句詩寫不出來，你說我能不來火嗎？

配制0.007 mol/L ABTS 溶液、0.002 45 mol/L 過硫酸鉀溶液，按1∶1 混合配制ABTS 自由基母液，在避光靜置16 h，于波長734 nm 處，乙醇稀釋，將ABTS 自由基母液吸光度控制在0.7±0.02，取0.4 mL不同質(zhì)量濃度黃酮提取液，加入ABTS 自由基稀釋液3 mL，避光靜置30 min，于波長734 nm 處測定吸光度A1；其他操作處理?xiàng)l件不變，將ABTS 自由基稀釋液替換成去離子水，測定吸光度A2；其他操作處理?xiàng)l件不變，將黃酮提取液替換成無水乙醇，測定吸光度A0[15]。以相同濃度的抗壞血酸作陽性對照。按公式（5）計(jì)算紅棗黃酮提取液的ABTS 自由基清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對紅棗總黃酮提取量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對紅棗總黃酮提取量的影響見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對紅棗總黃酮提取量的影響

由圖1 可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40～60%時(shí)，總黃酮提取量呈上升趨勢；乙醇體積分?jǐn)?shù)高于60%，總黃酮提取量呈下降趨勢，總黃酮提取量在60%乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)提取率最高。這可能是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)越高，醇溶性雜質(zhì)、色素及親脂性強(qiáng)的組分浸出量會(huì)增加，導(dǎo)致總黃酮類化合物提取率下降。

2.1.2 料液比對紅棗總黃酮提取量的影響

料液比對紅棗總黃酮提取量的影響見圖2。

圖2 料液比對紅棗總黃酮提取量的影響

由圖2 可知，在料液比為1∶25（g∶mL）時(shí)達(dá)到最高，隨著溶劑體積的增大，總黃酮提取量降低。這可能是因?yàn)檫m當(dāng)增加溶劑體積，總黃酮提取量增加；當(dāng)提取溶劑的體積到達(dá)一定值時(shí)，總黃酮提取量就會(huì)達(dá)到飽和，隨著溶劑體積增大，可能溶出了其他醇溶性的雜質(zhì)，影響顯色反應(yīng)降低吸光度。

2.1.3 超聲時(shí)間對紅棗總黃酮提取量的影響

超聲時(shí)間對紅棗總黃酮提取量的影響見圖3。

圖3 超聲時(shí)間對紅棗總黃酮提取量的影響

由圖3 可知，其他單因素條件不變，紅棗總黃酮的提取量在超聲時(shí)間10～40 min 內(nèi)呈上升趨勢，當(dāng)超聲時(shí)間超過40 min，總黃酮提取量降低，總黃酮提取量在超聲40 min 時(shí)提取效果最佳。這可能是因?yàn)榧t棗總黃酮隨著超聲時(shí)間變長，能在提取溶劑中充分析出，當(dāng)超聲時(shí)間到達(dá)一定值時(shí)，超聲時(shí)間過長會(huì)使本身具有抗氧化性的黃酮類化合物部分氧化，會(huì)使得提取量變低。

2.1.4 超聲溫度對紅棗總黃酮提取量的影響

超聲溫度對紅棗總黃酮提取量的影響見圖4。

圖4 超聲溫度對紅棗總黃酮提取量的影響

由圖4 可知，其他單因素提取條件不變，紅棗總黃酮提取量隨著超聲溫度升高而逐漸增大，當(dāng)超聲溫度超過60 ℃后，總黃酮提取量呈下降趨勢，提取效果在60 ℃達(dá)到最佳。溫度升高，會(huì)促進(jìn)分子的運(yùn)動(dòng)加快，從而促進(jìn)黃酮類化合物溶出；溫度超過60 ℃后，過高的溫度可能會(huì)破壞黃酮類物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，同時(shí)可能促使其他雜質(zhì)溶出，故總黃酮提取量會(huì)受到影響。

綜上所述，選取在超聲溫度60 ℃，料液比1∶25（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲時(shí)間40 min條件下提取紅棗總黃酮，紅棗總黃酮提取量可達(dá)到2.36 mg/g。

2.2 抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 紅棗總黃酮對DPPH 自由基的清除作用

紅棗總黃酮對DPPH 自由基的清除作用見圖5。

由圖5 可知，紅棗總黃酮提取液質(zhì)量濃度為2～10 mg/mL 內(nèi)時(shí)，對DPPH 自由基的清除效果呈上升趨勢，質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)清除率最高為76.89%，表明紅棗總黃酮提取液對DPPH 自由基具有明顯的清除效果。

圖5 紅棗總黃酮對DPPH 自由基的清除作用

2.2.2 紅棗總黃酮對羥自由基的清除作用

紅棗總黃酮對羥自由基的清除作用見圖6。

圖6 紅棗總黃酮對羥自由基的清除作用

羥自由基是在人體新陳代謝過程中產(chǎn)生毒性與危害最大的一種自由基，其可以使組織的糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)遭受氧化性損傷和破壞，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或突變。由圖6 可知，紅棗總黃酮提取液對羥自由基的清除率隨著樣液質(zhì)量濃度增大而上升，在10 mg/mL 時(shí)清除率最高為65.71%，紅棗總黃酮提取液具有一定的抗清除羥基自由基能力。

2.2.3 紅棗總黃酮對超氧陰離子的清除作用

紅棗總黃酮對超氧陰離子的清除作用見圖7。

圖7 紅棗總黃酮對超氧陰離子的清除作用

由圖7 可知，在質(zhì)量濃度為2～10 mg/mL 時(shí)，紅棗總黃酮提取液對超氧陰離子的清除作用隨著質(zhì)量濃度增大而增加，在10 mg/mL 時(shí)達(dá)到最大57.17%，表明紅棗總黃酮提取液本身對超氧陰離子具有較好清除能力。

2.2.4 紅棗總黃酮對Fe2+的還原能力測定

紅棗總黃酮對Fe2+的還原能力測定見圖8。

圖8 紅棗總黃酮對Fe2+的還原能力測定

由圖8 可知，隨著紅棗總黃酮提取液質(zhì)量濃度變大，吸光度增加，這表明紅棗總黃酮提取液對Fe2+的還原能力隨著紅棗總黃酮質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)，表明紅棗總黃酮提取液對Fe2+具有較好的還原能力。范艷麗等人[12]研究的紅棗核總黃酮對Fe2+的還原能力，紅棗核總黃酮在0.1～0.5 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的吸光度在0.1～0.4，還原能力且隨質(zhì)量濃度增大而提升至穩(wěn)定。試驗(yàn)中紅棗總黃酮提取液與參考中的紅棗核總黃酮對Fe2+的還原能力相近時(shí)，質(zhì)量濃度不同，說明試驗(yàn)中可能紅棗總黃酮提取液純度太低，且紅棗果肉總黃酮與紅棗核總黃酮差異比較大。

2.2.5 紅棗總黃酮對ABTS 自由基的清除作用

紅棗總黃酮對ABTS 自由基的清除作用見圖9。

圖9 紅棗總黃酮對ABTS 自由基的清除作用

由圖9 可知，紅棗總黃酮提取液對ABTS 自由基的清除率與樣液質(zhì)量濃度呈正比例關(guān)系，在質(zhì)量濃度為1 g/mL 時(shí)，清除率達(dá)到了最高為82.19%，表明紅棗總黃酮提取液對ABTS 自由基有較好清除效果。范艷麗等人[12]研究紅棗核總黃酮對ABTS 自由基的清除能力，紅棗核總黃酮在0.1～0.5 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對ABTS 自由基的清除率最高達(dá)到91%，且隨濃度增加而顯著提高紅棗總黃酮提取液清除ABTS 自由基能力增強(qiáng)。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)，確定以超聲溫度60 ℃，料液比1∶25（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲時(shí)間40 min 條件下提取紅棗總黃酮，研究了該提取方法對提取紅棗總黃酮影響，紅棗總黃酮提取量可達(dá)到2.360 mg/g。通過紅棗總黃酮提取液對DPPH 自由基、羥自由基、超氧陰離子、ABTS 自由基的清除效果及鐵離子的還原能力進(jìn)行考查，紅棗總黃酮提取液具有一定的抗氧活性，隨著提取液質(zhì)量濃度增大而增加，在質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)，DPPH 自由基、羥自由基、超氧陰離子的清除率達(dá)到最高，分別為76.89%，65.71%，57.17%，在質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)對ABTS 自由基清除率為82.19%。

試驗(yàn)所得為紅棗總黃酮提取液為粗提物，含有較多其他雜質(zhì)。紅棗作為新疆的特色果品，可尋求更多的開發(fā)途徑將紅棗資源充分開發(fā)利用，試驗(yàn)研究結(jié)果可為紅棗的進(jìn)一步深加工開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。