橄欖苦苷通過circMBOAT2/miR-106a-5p信號通路調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞CAL27增殖和凋亡的機(jī)制

李鋮 孫紅玲 顧超

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院江北院區(qū)口腔科，江蘇 南京 210000)

口腔癌是全球第六大常見癌癥，2018年全球口腔癌新增病例高達(dá)35萬例[1]?？谇击[癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)是口腔癌的主要亞型，臨床主要采用手術(shù)聯(lián)合放療治療策略，但由于侵襲性強(qiáng)、惡性程度高以及腫瘤耐藥，OSCC患者的預(yù)后仍不甚理想。中醫(yī)藥作為醫(yī)學(xué)的重要組成部分，對惡性腫瘤的治療越來越受到重視。橄欖苦苷是橄欖果實和橄欖葉的主要多酚成分，體外研究表明該化合物在結(jié)腸癌、肝癌、乳腺等多種癌癥中顯示出細(xì)胞毒性、促凋亡、抗增殖和抗轉(zhuǎn)移作用[2-3]。此外，橄欖苦苷還可抑制裸鼠卵巢癌、子宮頸癌移植瘤形成[4-5]。然而，橄欖苦苷在OSCC中的抗腫瘤作用尚未闡明。環(huán)狀RNA(circRNA)是由前體mRNA選擇性剪接形成的非編碼RNA，通常在多種組織和細(xì)胞中表達(dá)，并通過circRNA-miRNA信號軸參與OSCC細(xì)胞生物學(xué)行為，具有OSCC臨床生物標(biāo)志物和治療靶點的巨大潛力[6]。研究表明前列腺癌中circRNA MBOAT2(circMBOAT2)高表達(dá)與高Gleason評分、晚期病理分期和預(yù)后不良相關(guān)，并增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)體內(nèi)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[7]。生物信息分析預(yù)測到miR-106a-5p是circMBOAT2的潛在靶點。OSCC中miR-106a-5p表達(dá)下調(diào)，miR-106a-5p通過抑制己糖激酶2(HK2)在OSCC中發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。預(yù)實驗顯示橄欖苦苷處理能夠改變OSCC細(xì)胞circMBOAT2和miR-106a-5p水平?；诖耍狙芯恳詂ircMBOAT2/ miR-106a-5p通路為切入點，探討橄欖苦苷在OSCC中抗腫瘤作用，旨在為橄欖苦苷在臨床OSCC治療中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源 收集2018年3月～2019年11月在我院行手術(shù)切除的31例OSCC患者的癌組織和匹配的鄰近正常癌旁組織。男性20例，女性11例，年齡35～72歲，中位年齡52歲。切除后立即將新鮮組織放入液氮中保存。納入本研究的患者均經(jīng)病理診斷，術(shù)前未行放療、化療等治療。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.1.2 細(xì)胞和試劑 CAL27細(xì)胞購自美國ATCC；橄欖苦苷(純度大于95%，BP1028)購自成都普瑞法科技公司；Prime Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑購自大連Takara公司；Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司；靶向circMBOAT2的小干擾RNA(si-circMBOAT2)及其陰性對照(si-NC)、circMBOAT2過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-circMBOAT2)購自上海吉瑪制藥公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(ab9485)、剪切型半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)兔多抗(ab2302)、羊抗兔IgG二抗(ab205718)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自上海艾博抗公司；總RNA提取試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)凋亡檢測試劑盒、放射免疫沉淀測定(RIPA)試劑、雙熒光素酶報告試劑盒購自北京索萊寶科技公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測并驗證circMBOAT2與口腔鱗癌的相關(guān)性 RT-qPCR檢測OSCC組織中circMBOAT2和miR-106a-5p表達(dá)，用總RNA提取試劑盒分離OSCC組織和癌旁組織的總RNA，測定總RNA純度和濃度合格后利用Prime Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg總RNA合成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq試劑以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。circMBOAT2上游引物5′-GGAGTGGA GAACATGCACAA-3′，下游引物5′-AAGGCAAAG AGTTGGCACAC-3′；GAPDH上游引物5′-GGCCT CCAAGGAGTAAGACC-3′，下游引物5′-AGGGGA GATTCAGTGTGGTG-3′；miR-106a-5p上游引物5′-GATGCTCAAAAAGTGCTTACAGTGCA-3′，下游引物5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′；U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAA AAT-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTG TCAT-3′。

1.2.2 CAL27細(xì)胞的培養(yǎng)和分組 CAL27細(xì)胞在DMEM中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素。培養(yǎng)箱條件為37℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度。轉(zhuǎn)染前一天將對數(shù)期CAL27細(xì)胞1×104個/孔接種6孔板，用Lipofectamine 2000試劑將si-circMBOAT2、si-NC、pcDNA-circMBOAT2分別轉(zhuǎn)染50%融合的CAL27細(xì)胞。收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞按照“1.2.1”步驟檢測circMBOAT2表達(dá)水平。分別用含0 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL橄欖苦苷[11]的培養(yǎng)液孵育CAL27細(xì)胞，記為橄欖苦苷0 μg/mL、橄欖苦苷200 μg/mL、橄欖苦苷400 μg/mL、橄欖苦苷800 μg/mL組；轉(zhuǎn)染si-circMBOAT2、si-NC的CAL27細(xì)胞分別記為si-circMBOAT2組、si-NC組；用含800 μg/mL橄欖苦苷的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染pcDNA-circMBOAT2的CAL27細(xì)胞，記為橄欖苦苷800 μg/mL+pcDNA-circMBOAT2組。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染48 h CAL27細(xì)胞，未轉(zhuǎn)染CAL27細(xì)胞均以2×103個/孔接種96孔板。按照“1.2.2”分組用對應(yīng)濃度的橄欖苦苷孵育細(xì)胞48 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK-8溶液和90 μL培養(yǎng)液。孵育2 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度(A)。抑制率(%)=(1-實驗A/對照A)×100%

1.2.4 集落形成實驗檢測集落形成數(shù) 胰酶消化各組CAL27細(xì)胞，PBS洗滌兩次。以3×102個/孔將各組CAL27細(xì)胞接種6孔板，輕旋平板使細(xì)胞分散均勻。放入37℃培養(yǎng)箱孵育8～14 d，當(dāng)看到細(xì)胞集落時終止培養(yǎng)，棄去細(xì)胞懸液。用5%多聚甲醛固定細(xì)胞集落，0.05%結(jié)晶紫染色。計數(shù)大于50個細(xì)胞的集落數(shù)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 胰酶消化各組CAL27細(xì)胞，PBS洗滌兩次。用500 μL的1×結(jié)合緩沖液中重懸細(xì)胞沉淀，加入5 μL annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光染色15 min。流式細(xì)胞儀用于測定CAL27細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測Cleaved-caspase3蛋白表達(dá) 用RIPA試劑裂解轉(zhuǎn)染各組CAL27細(xì)胞，用BCA法測定濃度。取20 μg變性蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉NC膜后，用一抗(Cleaved-caspase3抗體1∶500稀釋，GAPDH抗體1∶3000稀釋)在4℃下孵育NC膜過夜。在室溫下用二抗(1∶2500稀釋)與NC膜反應(yīng)2 h。使用ECL試劑盒測定蛋白條帶。用Quantity One軟件定量Cleaved-caspase3蛋白相對表達(dá)量。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗 將含有miR-106a-5p結(jié)合位點的circMBOAT2野生型(WT)序列或不含該結(jié)合位點的circMBOAT2突變(MUT)序列克隆到pGL3質(zhì)粒，構(gòu)建熒光素酶報告載體WT-circMBOAT2、MUT-circMBOAT2。將WT-circMBOAT2+miR-106a-5p、WT-circMBOAT2+miR-NC、MUT-circMBOAT2+miR-106a-5p、MUT-circMBOAT2+miR-NC分別轉(zhuǎn)染到CAL27細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h，用雙熒光素酶報告試劑盒測定熒光素酶活性。相對熒光素酶強(qiáng)度以螢火蟲與海腎熒光素酶活性的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR檢測circMBOAT2和miR-106a-5p在OSCC中的表達(dá) OSCC組織中circMBOAT2相對水平高于癌旁組織，miR-106a-5p相對水平低于癌旁組織(均P<0.05)，見圖1A、圖1B。OSCC組織中circMBOAT2和miR-106a-5p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，見圖1C。

圖1 circMBOAT2和miR-106a-5p表達(dá)及相關(guān)性分析(n=31)

2.2 橄欖苦苷對CAL27增殖、凋亡的影響 與橄欖苦苷0 μg/mL組比較，橄欖苦苷(200、400、800 μg/mL)組CAL27細(xì)胞集落形成數(shù)顯著減少(P<0.05)，增殖抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。隨著橄欖苦苷濃度的增加，其對CAL27細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)，見圖2、表1。

圖2 橄欖苦苷誘導(dǎo)CAL27凋亡及促進(jìn)Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)

表1 橄欖苦苷抑制CAL27增殖誘導(dǎo)凋亡

2.3 橄欖苦苷對CAL27中circMBOAT2和miR-106a-5p表達(dá)的影響 與橄欖苦苷0 μg/mL組比較，橄欖苦苷(200、400、800 μg/mL)組CAL27細(xì)胞circMBOAT2相對水平顯著降低(P<0.05)，miR-106a-5p相對水平顯著升高(P<0.05)。隨著橄欖苦苷濃度的增加，其對CAL27細(xì)胞circMBOAT2表達(dá)的抑制作用、對miR-106a-5p表達(dá)的促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)，見圖3。

2.4 circMBOAT2靶向miR-106a-5p starbase預(yù)測到circMBOAT2和miR-106a-5p存在互補(bǔ)序列(圖4)。WT-circMBOAT2和miR-106a-5p共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相對熒光素酶強(qiáng)度低于WT-circMBOAT2和miR-NC共轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；MUT-circMBOAT2和miR-106a-5p共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相對熒光素酶強(qiáng)度與MUT-circMBOAT2和miR-NC共轉(zhuǎn)染組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.5 沉默circMBOAT2對CAL27增殖、凋亡的影響 與si-NC組比較，si-circMBOAT2組CAL27細(xì)胞circMBOAT2相對水平、集落形成數(shù)顯著降低(P<0.05)，miR-106a-5p相對水平、增殖抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見圖5、表3。

圖3 橄欖苦苷抑制circMBOAT2及促進(jìn)miR-106a-5p表達(dá)

圖4 circMBOAT2和miR-106a-5p互補(bǔ)序列

表2 雙熒光素酶報告實驗

圖5 沉默circMBOAT2誘導(dǎo)CAL27凋亡及促進(jìn)Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)

表3 沉默circMBOAT2抑制CAL27增殖誘導(dǎo)凋亡

2.6 過表達(dá)circMBOAT2對橄欖苦苷處理的CAL27增殖、凋亡的影響 與橄欖苦苷 0 μg/mL組比較，橄欖苦苷 800 μg/mL組CAL27細(xì)胞circMBOAT2相對水平、集落形成數(shù)顯著降低(P<0.05)，miR-106a-5p相對水平、增殖抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與橄欖苦苷 800 μg/mL組比較，橄欖苦苷800 μg/mL+pcDNA-circMBOAT2組CAL27細(xì)胞circMBOAT2相對水平、集落形成數(shù)顯著升高(P<0.05)，miR-106a-5p相對水平、增殖抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖6、表4。

圖6 過表達(dá)circMBOAT2可減弱橄欖苦苷對CAL27凋亡的誘導(dǎo)作用及Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用

表4 過表達(dá)circMBOAT2可減弱橄欖苦苷對CAL27增殖凋亡的作用

3 討論

中藥的作用包括抑制腫瘤細(xì)胞生長、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、減少癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，在惡性腫瘤治療方面具有獨特優(yōu)勢[9]。橄欖苦苷是多酚類活性化合物，具有抗氧化、抑菌、抗炎、降壓和抗癌作用[10]。橄欖苦苷可通過誘導(dǎo)雌激素受體陽性乳腺癌細(xì)胞的自噬來抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲[11]，通過抑制蛋白激酶B(AKT)信號通路進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[12]，通過激活caspase途徑來誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷以劑量依賴方式抑制OSCC細(xì)胞CAL27增殖和集落形成能力，激活Cleaved- caspase3并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明橄欖苦苷在OSCC中具有抗腫瘤活性。circRNA和miRNA是腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控的關(guān)鍵因子，其表達(dá)失調(diào)與腫瘤啟動、進(jìn)展息息相關(guān)[14]。研究發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷可改變miRNA的表達(dá)發(fā)揮腫瘤活性，例如橄欖苦苷可下調(diào)肝癌中致癌因子miR-155-5p水平，上調(diào)抗癌因子miR-194-5p水平[15]。橄欖苦苷通過緩解缺氧誘導(dǎo)因子對miR-299表達(dá)的抑制作用，進(jìn)而提高卵巢癌細(xì)胞的放射敏感性[16]。本研究中橄欖苦苷處理后CAL27細(xì)胞中circMBOAT2表達(dá)下調(diào)，miR-106a-5p表達(dá)上調(diào)，提示橄欖苦苷可能通過抑制circMBOAT2表達(dá)，促進(jìn)miR-106a-5p表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤活性的作用。

已有研究證實circMBOAT2在結(jié)直腸癌組織和血清樣本中均高表達(dá)，是結(jié)直腸癌潛在診斷和獨立預(yù)后標(biāo)志物，circMBOAT2通過靶向miR-519d-3p促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[17]。沉默circMBOAT2能夠抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和谷氨酰胺分解代謝，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。本研究發(fā)現(xiàn)OSCC組織中circMBOAT2表達(dá)上調(diào)，miR-106a-5p表達(dá)下調(diào)，且OSCC組織中circMBOAT2和miR-106a-5p水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系?，F(xiàn)有報道關(guān)于miR-106a-5p在腫瘤進(jìn)展中的作用并不一致，部分研究報道卵巢癌中miR-106a-5p表達(dá)增加并發(fā)揮促增殖、促轉(zhuǎn)移作用[19]。亦有研究顯示星形細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞癌中miR-106a-5p表達(dá)下降，過表達(dá)miR-106a-5p可降低腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力[20-21]。本研究證實miR-106a-5p是circMBOAT2的直接靶點，其表達(dá)在CAL27細(xì)胞中受circMBOAT2負(fù)調(diào)控。功能分析顯示沉默circMBOAT2可抑制CAL27細(xì)胞增殖和集落形成能力，激活Cleaved-caspase3并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與橄欖苦苷對CAL27細(xì)胞抗癌效果類似。為證實橄欖苦苷的抗腫瘤作用與下調(diào)circMBOAT2有關(guān)，本研究將pcDNA- circMBOAT2轉(zhuǎn)染CAL27細(xì)胞，結(jié)果表明，過表達(dá)circMBOAT2部分逆轉(zhuǎn)了橄欖苦苷對CAL27細(xì)胞的增殖抑制作用以及對miR-106a-5p表達(dá)、細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，證實橄欖苦苷至少通過下調(diào)circMBOAT2/miR-106a-5p途徑抑制CAL27細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

橄欖苦苷可抑制OSCC細(xì)胞CAL27增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制是通過下調(diào)circMBOAT2/miR-106a-5p途徑實現(xiàn)的。這些發(fā)現(xiàn)表明橄欖苦苷具有防治OSCC進(jìn)展的巨大潛力，circMBOAT2和miR-106a-5p可能是OSCC分子靶向治療的候選靶標(biāo)。