張游俠 嚴(yán)其康 陳玉然 郝佳奇 朱金玲
(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)
原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)簡稱肝癌,指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤,是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)最新統(tǒng)計,HCC全球發(fā)病率已超過62.6萬/年,居于惡性腫瘤的第5位, 正嚴(yán)重威脅人類健康和生命。中國是肝癌的高發(fā)國家,2020 年新增與死于HCC的患者均處于世界前列[1]。盡管目前外科手術(shù)、消融治療等技術(shù)日益發(fā)展,但由于腫瘤復(fù)發(fā)和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致HCC患者的5年生存率仍然很低。因此,探索肝癌生物學(xué)的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,尋找新的治療靶點以改善目前HCC的治療方式有著重要意義。MicroRNA(miRNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一種十分重要的非編碼小RNA, miRNA在基因調(diào)控中起重要作用,其通過基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控來調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生理過程,其中包括細(xì)胞凋亡,炎癥,腫瘤發(fā)生等[2], miRNA在肝癌中也發(fā)揮著重要功能,主要通過抑制基因以及靶向致癌基因在癌癥的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移過程中進(jìn)行有效參與[3]。miRNA-34a是miRNA的一種,活化的miRNA-34a可阻止腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤[4]。有多項研究顯示miRNA-34a在肝癌中表達(dá)水平顯著低于癌旁組織,miRNA-34a參與肝癌的發(fā)生發(fā)展,與肝癌惡性程度密切相關(guān)[5-6],還有研究報道,在乳腺癌,胃癌,肺癌等多種人類癌癥中miRNA-34a的表達(dá)也異常增高[7-8],但其作用機(jī)制并不明了,又因Bcl-2在肝癌組織中高表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡?;诖耍狙芯客ㄟ^體外過表達(dá)miRNA-34a,探討miRNA-34a與Bcl-2的靶向調(diào)節(jié),以及miRNA-34a對肝癌HepG2細(xì)胞增殖和遷移能力的影響,為肝癌的治療提供新靶點。
1.1 主要材料與試劑 人肝癌細(xì)胞系HepG2購于中國科學(xué)院生物科學(xué)研究所;FBS 和DMEM購于美國Gibco公司;riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑盒、miRNA-34a mimics(miRNA-34a模擬物)和其陰性對照物mimics NC購于中國銳博生物;雙熒光素酶測定試劑盒購于中國易錦生物;Trans-well小室購于美國Corning公司; MiniBEST通用RNA提取試劑盒、Prime Script RT Master Mix試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII購于中國Takara公司;Western blot細(xì)胞裂解緩沖液,ECL曝光液購于中國碧云天生物;Bcl-2 Antibody,Gapdh Antibody購于美國Affinity公司。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 在含有10%FBS的DMEM中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。在37℃,5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將肝癌細(xì)胞分為2個組:對照組(轉(zhuǎn)染miRNA-34a陰性對照物mimic NC);miRNA-34a轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染miRNA-34a模擬物)。細(xì)胞以1.8×105/孔的密度接種于24孔板中。依據(jù)試劑說明書使用riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑盒試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
1.2.2 CCK8檢測miRNA-34a對肝癌細(xì)胞活力的影響 細(xì)胞以3×103/孔的密度接種于96孔板中培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染。檢測1、2、3、4、5、6和7 d的細(xì)胞活力(在450 nm波長下檢測樣品OD值)。最后以吸光度值為縱軸,時間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。
1.2.3 miR-34a靶標(biāo)預(yù)測 用TargetScan(http://www.targetscan.org)數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-34a的靶標(biāo)基因。
1.2.4 熒光素酶報告基因檢測miRNA-34a對Bcl-2靶向調(diào)控 把miRNA-34a模擬物和熒光素報告對照載體分別與wild-type of Bcl-2、mutant of Bcl-2和Negative control的pEZX-MT06的熒光素酶報告載體一起共轉(zhuǎn)染(表1)。轉(zhuǎn)染后36 h,使用雙熒光素酶測定試劑盒檢測熒光素酶活性。
表1 熒光素酶報告基因檢測分組
1.2.5 Trans-well檢測miRNA-34a對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL, 取200 μL接種于transwell小室上室中,下室加入含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液550 μL。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后,PBS清洗,再用4%多聚甲醛固定10 min,并在室溫下用吉姆薩染色液染色10 min。最后使用顯微鏡拍照計數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)目(吉姆薩染色細(xì)胞數(shù))。
1.2.6 qRT-PCR檢測過表達(dá)miRNA-34a對肝癌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)量的影響 將培養(yǎng)的細(xì)胞按TaKaRa MiniBEST通用RNA提取試劑盒說明書操作提取細(xì)胞總RNA,按Prime Script RT Master Mix試劑盒說明書操作進(jìn)行cDNA合成。使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII試劑盒進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng),Gapdh為內(nèi)參基因,Bcl-2基因的引物序列為F: ATT GTGGCCTTCTTTGAGTTCG,R:CATCCCAGCCT CCGTTATCC;內(nèi)參Gapdh基因的引物序列為F:CCAAAATCAGATGGGGCAATGCTGG,R:TGAT GGCATGGACTGTGGTCATTCA。相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算。
1.2.7 Western blot檢測過表達(dá)miRNA-34a對肝癌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)量的影響 收集培養(yǎng)好的細(xì)胞提取總蛋白并測定濃度,SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜(用含5%脫脂奶粉的TBS溶解液, 37℃孵育PVDF膜),封閉1 h,然后一抗孵育過夜(Bcl-2,1∶500;Gapdh,1∶5000;4℃)。然后室溫孵育二抗1 h,使用ECL溶液曝光,最后使用Tanon凝膠軟件分析系統(tǒng)分析蛋白質(zhì)條帶的光密度值,以目的條帶和Gapdh條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。
2.1 過表達(dá)miRNA-34a抑制HepG2細(xì)胞的增殖能力 CCK8實驗結(jié)果顯示,miR-34a 轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞活力明顯低于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。
2.2 過表達(dá)miRNA-34a抑制HepG2細(xì)胞的遷移能力 轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞進(jìn)行Transwell小室遷移實驗,結(jié)果顯示,miRNA-34a轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移能力
表2 過表達(dá)miRNA-34a抑制肝癌細(xì)胞增殖
明顯低于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。
圖1 過表達(dá)miRNA-34a抑制HepG2細(xì)胞的遷移能力(n=3)
2.3 Bcl-2是miRNA-34a的下游靶標(biāo) 生物信息學(xué)方法預(yù)測Bcl-2是miRNA-34a的潛在下游靶標(biāo)(圖2A)。在HepG2細(xì)胞中進(jìn)行雙熒光素酶實驗證實Bcl-2是miRNA34a的靶點(圖2B),雙熒光素酶報告基因的檢測結(jié)果表明,過表達(dá)miRNA-34a可顯著下調(diào)Bcl-2野生型熒光素酶報告基因的活性(P<0.01),并且對其它組無作用。
圖2 Bcl-2是miRNA-34a的下游靶標(biāo)(n=3)
2.4 在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)miRNA-34a下調(diào)Bcl-2的表達(dá) qRT-PCR和Western blot實驗結(jié)果均顯示miRNA-34a組的Bcl-2表達(dá)量明顯低于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。
圖3 miRNA-34a在肝癌細(xì)胞中下調(diào)Bcl-2的表達(dá)量(n=3)
肝癌對人類的健康和生活產(chǎn)生了巨大的危害,肝癌的發(fā)病率在不斷增加。因此研究肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、尋找一種可以用于治療肝癌的新靶點是我們急需解決的問題。近十幾年來,miRNA這種表觀遺傳學(xué)調(diào)控分子受到了越來越多的關(guān)注,有多種miRNA參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展,與肝癌臨床惡性表型及抗藥性密切相關(guān)[9-11]。miRNA-34a在多種癌癥中均表達(dá)異常[12-14]。此外有研究報道,在肝癌患者中miRNA-34a低表達(dá)[5-6],這表明miRNA-34a可能參與肝癌的發(fā)展過程。為此本研究將miRNA-34a mimics NC和miRNA-34a mimics分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入HepG2細(xì)胞來研究miRNA-34a對肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力的影響,通過CCK8和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miRNA-34a能夠明顯的抑制HepG2細(xì)胞的活力和遷移能力, 研究結(jié)果與郭瑛等[15]的研究結(jié)果類似。表明過表達(dá)某些miRNA可抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力,因此推測miRNA-34a可能有助于治療肝癌。在其他類型的人類癌癥中也有類似的發(fā)現(xiàn)。為了更加深入的了解miRNA-34a抑制HepG2細(xì)胞的活力和遷移能力的原因,本研究推測這與其下游靶標(biāo)有關(guān),因此應(yīng)用生物信息學(xué)方法Target Scan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA-34a的下游靶標(biāo),篩選出腫瘤界中備受關(guān)注的癌基因Bcl-2。近年來Bcl-2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中被廣泛關(guān)注[16],Bcl-2能夠參與細(xì)胞凋亡的起始階段,和Bax等促凋亡蛋白結(jié)合,阻止線粒體膜透化(MOMP),防止細(xì)胞色素C等凋亡因子從線粒體中釋放,最終達(dá)到抗細(xì)胞凋亡的作用[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2高表達(dá)的細(xì)胞增殖能力和遷移能力高,這種現(xiàn)象在其他腫瘤中也得到了證實[19]。另外還有研究報道Bcl-2不僅可以影響肝癌細(xì)胞的生長,侵襲等,而且對肝癌的耐藥性也有影響[20]。這些都表明Bcl-2作為癌基因在肝癌中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步驗證miRNA-34a是怎樣發(fā)生生物作用,本研究用雙熒光素酶報告實驗確定了BcL-2是miRNA-34a的靶基因,并且通過qRT-PCR和Western blot的實驗結(jié)果確定了miRNA-34a能夠直接下調(diào)Bcl-2的表達(dá)。
總之,以上結(jié)果表明miRNA-34a對肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力具有抑制作用并且這種作用可能是通過miRNA-34a直接靶向并下調(diào)Bcl-2而造成的。本研究不僅為肝癌的發(fā)生和發(fā)展的潛在機(jī)制提供了新的見解,而且還為肝癌的治療提供了新的思路。但是miRNA-34a的靶標(biāo)不僅只有Bcl-2,還有許多其他的靶標(biāo)。因此miRNA-34a對肝癌的影響可能還有其它的機(jī)制。為此,在后續(xù)的研究中會進(jìn)一步探討。
miRNA-34a可靶向并負(fù)向調(diào)控Bcl-2的表達(dá),降低肝癌細(xì)胞HepG2的活力和遷移能力,可為肝癌的治療提供新靶點,并為探討肝癌的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。