稻螟赤眼蜂實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選

王珊珊，田俊策*，魯艷輝，徐紅星，王香萍*，呂仲賢*

（1.農(nóng)林病蟲(chóng)害預(yù)警與調(diào)控湖北省工程中心，長(zhǎng)江大學(xué)，荊州 434025；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所/農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310021）

稻螟赤眼蜂Trichogramma japonicum隸屬于膜翅目Hymenoptera，赤眼蜂科Trichogrammatidae[1]。稻螟赤眼蜂是稻田赤眼蜂的優(yōu)勢(shì)種群，其對(duì)稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis、二化螟Chilo suppressalis等水稻鱗翅目害蟲(chóng)具有良好的防治效果[2,3]。近年來(lái)，由于二化螟等水稻鱗翅目害蟲(chóng)的抗藥性問(wèn)題日益突出以及綠色防控技術(shù)的持續(xù)推廣，淹沒(méi)式釋放稻螟赤眼蜂防治水稻鱗翅目害蟲(chóng)的應(yīng)用面積在日益增長(zhǎng)中。隨著稻螟赤眼蜂生物防治應(yīng)用的擴(kuò)大，對(duì)其繁育、滯育、農(nóng)藥抗性等分子機(jī)制方面的研究也逐漸增多。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)基因表達(dá)定量方面的研究。qRT-PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上引入熒光基團(tuán)，通過(guò)相應(yīng)的熒光信號(hào)積聚實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)反應(yīng)的進(jìn)程，為未知序列進(jìn)行定量分析的方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[4,5]。在實(shí)際應(yīng)用中，眾多因素的不穩(wěn)定會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成直接影響，如RNA提取、cDNA合成及PCR擴(kuò)增效率等。為了降低各因素對(duì)其結(jié)果的影響，需要對(duì)靶基因的結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，而內(nèi)參基因是校正樣本間的差異、對(duì)靶基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理的關(guān)鍵因素。同時(shí)，為減少樣品之間和樣品內(nèi)部的誤差，常用表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，因此選擇合適的內(nèi)參基因?qū)ζ浣Y(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要[6-8]。常用于定量試驗(yàn)的內(nèi)參基因有肌動(dòng)蛋白基因（Actin）、多聚泛素酶基因（Ubiquitin，UBQ）、微管蛋白基因（Tubulin，TUB）、轉(zhuǎn)錄延伸因子（EF1a）和泛素結(jié)合酶基因（Ubiquitin-conjugating enzyme，UBC）等管家基因[9]。研究表明，內(nèi)參基因不存在絕對(duì)通用性，未經(jīng)篩選的內(nèi)參基因進(jìn)行校正處理可能使結(jié)果不準(zhǔn)確，甚至是錯(cuò)誤的[10]。因此，基于不同的物種、樣本材料、發(fā)育階段和試驗(yàn)條件來(lái)篩選出穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因至關(guān)重要。

本研究共挑選了10個(gè)潛在的內(nèi)參基因，包括6種常用作為內(nèi)參基因的基因ACTR2、ARPC2、EF1a、EEF1D、HSP70和GAPDH以及從熱刺激處理稻螟赤眼蜂轉(zhuǎn)錄組中挑選的4種穩(wěn)定表達(dá)基因TMEM209、PABPC1L、SFRS7和CSNK1a1，探討其在溫度處理、食物處理、農(nóng)藥處理和不同發(fā)育歷期下供試基因的表達(dá)穩(wěn)定性，為不同試驗(yàn)條件下選擇合適的稻螟赤眼蜂內(nèi)參基因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

試驗(yàn)所用米蛾Corcyra cephalonica卵飼養(yǎng)在相對(duì)濕度為75%±5%，溫度為（26±1）℃的人工氣候室。多代繁育的米蛾在60目的鐵紗網(wǎng)上產(chǎn)卵后用軟毛刷收集獲得。將當(dāng)天收集的新鮮米蛾卵粘附于有雙面膠的紙片（長(zhǎng)2 cm，寬1 cm）上制成米蛾卵卡，然后30 W紫外燈正下方30 cm處照射殺胚45 min，供繁蜂用。

稻螟赤眼蜂為杭州蕭山稻田中采集被寄生的二化螟卵，室內(nèi)鑒定純化后，利用中間寄主米蛾卵培養(yǎng)獲得，稻螟赤眼蜂種群用已滅活的米蛾卵在人工氣候室內(nèi)（溫度25 ℃±1 ℃、相對(duì)濕度75%±5%、光周期14L∶10D）繁殖多代后用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)分組及處理

1.2.1 溫度處理 將羽化4 h的成蜂分別在高溫40 ℃和低溫0 ℃下刺激1 h后，放回25 ℃培養(yǎng)箱恢復(fù)1 h后收集樣品，以一直在25 ℃培養(yǎng)箱（未受高溫低溫刺激）的稻螟赤眼蜂成蜂為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次，以300頭稻螟赤眼蜂為1個(gè)重復(fù)。取樣后，液氮冷凍處理，-80 ℃保存直至RNA提取。

1.2.2 取食處理 將羽化4 h的成蜂分為3個(gè)處理，處理1不喂食任何食物作為對(duì)照，處理2提供清水，處理3提供10%的蔗糖水。任其取食4 h后，收集樣品。每個(gè)處理重復(fù)3次，以300頭稻螟赤眼蜂為1個(gè)重復(fù)。取樣后，液氮冷凍處理，-80 ℃保存直至RNA提取。

1.2.3 不同農(nóng)藥處理 選擇 2種稻田常用的防治褐飛虱的農(nóng)藥吡蟲(chóng)啉和吡蚜酮，將原藥溶于丙酮，以1 mg/mL的濃度制備藥膜管。將羽化4 h的成蜂引入藥膜管中刺激1 h，放回培養(yǎng)箱恢復(fù)1 h后收集樣品，以丙酮藥膜管為陰性對(duì)照，以未引入藥膜管的為空白對(duì)照組。每個(gè)處理重復(fù)3次，以300頭稻螟赤眼蜂為1個(gè)重復(fù)。取樣后，液氮冷凍處理，-80 ℃保存直至RNA提取。

1.2.4 不同發(fā)育歷期樣本 分別收集寄生5 d后的蛹期寄生蜂和羽化4 h的赤眼蜂成蜂，每個(gè)蟲(chóng)態(tài)重復(fù)取樣3次，每個(gè)重復(fù)收集300頭稻螟赤眼蜂。樣品收集后，液氮冷凍處理，-80 ℃保存直至RNA提取。

1.3 總RNA的提取與cDNA的合成

利用TRIzol Reagent劑（北京寶盈同匯生物技術(shù)有限公司）對(duì)稻螟赤眼蜂樣品分別提取RNA，具體步驟參照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)。并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)各樣品的RNA質(zhì)量，RNA電泳條帶清晰完整，說(shuō)明提取的RNA質(zhì)量較好。進(jìn)一步測(cè)得RNA OD260/OD280值，確定RNA的濃度及純度。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，合成cDNA，操作步驟參照Thermo Fisher反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，合成的cDNA保存在-20 ℃冰箱備用。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)候選內(nèi)參基因引物特異性和擴(kuò)增效率

利用 Prime 3.0軟件設(shè)計(jì)稻螟赤眼蜂的候選基因特異性引物（表 1）。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)使用Bio-Rad CFX96 real-time system，按照iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix（Bio-Rad，USA）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)體系 20 μL，包含 cDNA 1 μL、上下游引物各 1 μL、iTaq Universal SYBR Green Supermix（2×）10 μL、ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s循環(huán)40次。熔解曲線：60 ℃～95 ℃，每升高0.5 ℃收集一次熒光信號(hào)。每個(gè)cDNA樣品設(shè)置2個(gè)技術(shù)重復(fù)。cDNA按5倍等比稀釋成5個(gè)不同濃度，獲得引物擴(kuò)增效率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

qRT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)儀器自帶的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到各個(gè)反應(yīng)的Ct值。通過(guò)Delta-Ct、NormFinder、geNorm和BestKeeper四種方法對(duì)內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。Delta-Ct是某內(nèi)參基因相對(duì)于其他各內(nèi)參基因ΔCt的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的平均值對(duì)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行排序，顯示兩種內(nèi)參基因之間的表達(dá)差異[11]?；诨虻南鄬?duì)表達(dá)量（2-ΔCt），NormFinder是根據(jù)組內(nèi)和組間的差異對(duì)參考基因進(jìn)行排名[12]。GeNorm是對(duì)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值M值進(jìn)行分析并排序，M值越小，基因表達(dá)穩(wěn)定性越好[13]。內(nèi)參基因的最佳數(shù)量通過(guò)geNorm計(jì)算的配對(duì)變異值Vn/（n＋1）確定。當(dāng)變異值＜0.15時(shí)，內(nèi)參基因的最佳數(shù)量為n，當(dāng)其＞0.15時(shí)，應(yīng)當(dāng)選n＋1個(gè)內(nèi)參基因做進(jìn)一步校正。BestKeeper是通過(guò)計(jì)算各內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）對(duì)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行排序，SD和CV越小，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好[14]。最后通過(guò)RefFinder（http://blooge.cn/RefFinder/?type=reference）軟件對(duì)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選內(nèi)參基因引物特異性分析及擴(kuò)增效率檢測(cè)

以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR分析各樣品的熔解曲線，顯示10個(gè)內(nèi)參基因均呈現(xiàn)單一的信號(hào)峰（圖1），同時(shí)將切膠回收的條帶經(jīng)測(cè)序比對(duì)后確定為靶標(biāo)基因的特異性條帶。對(duì)擴(kuò)增效率進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果顯示10個(gè)候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率在96.70%～115.10%，相關(guān)系數(shù)R2在0.991～1.000（表1）。

表1 侯選基因引物信息Table 1 Primers for the candidate genes

圖1 候選基因的熔解曲線Fig.1 Melting curves of the candidate genes

2.2 候選內(nèi)參基因表達(dá)水平

CT值是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，它能反應(yīng)內(nèi)參基因的表達(dá)水平。CT值越大，表明基因的表達(dá)量越低。10個(gè)候選內(nèi)參基因的CT值在14.65～24.02。其中PAPBC1L和EF1a的CT值顯著低于其他基因（F＝306.4，P＜0.001），表明該基因的表達(dá)豐富度較高；而ACTR2的CT值要顯著高于其他基因，表明該基因的表達(dá)豐富度為候選內(nèi)參基因中最低（圖2）。

圖2 候選內(nèi)參基因的CT值Fig.2 CT value of candidate reference genes

2.3 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.3.1 溫度對(duì)稻螟赤眼蜂候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響 在不同溫度刺激下 Delta CT、NormFinder和GeNorm軟件分析均表明，基因EF1a是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而B(niǎo)estKeeper分析表明基因CSNK1a1是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，ACTR2和GAPDH兩個(gè)內(nèi)參基因在各分析軟件中表達(dá)較不穩(wěn)定（圖3）。根據(jù) RefFinder綜合分析，在不同溫度刺激下，10個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性從高到低依次是EF1a＞EEF1D＞PABPC1L＞TMEM209＞SFRS7＞ARPC2＞CSNK1a1＞HSP70＞GAPDH＞ACTR2（表 2）。

表2 溫度對(duì)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的影響Table 2 Effect of temperature on the stability of candidate reference genes

2.3.2 取食對(duì)稻螟赤眼蜂內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響 不同的取食處理下，Delta CT、BestKeeper、NormFinder和GeNorm軟件分析均表明GAPDH基因的穩(wěn)定性是最低的，其次是ACTR2基因。ARPC2基因在BestKeeper和GeNorm軟件分析中，表達(dá)最穩(wěn)定；EF1a基因在NormFinder軟件分析中，表達(dá)最穩(wěn)定。與其他分析軟件不同的是，GeNorm分析結(jié)果表明TMEM209基因的表達(dá)穩(wěn)定性最好（表3）。利用RefFinder軟件綜合分析，結(jié)果表明10個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性從高到低依次是SFRS7＞ARPC2＞EF1a＞TMEM209＞CSNK1a1＞PABPC1L＞EEF1D＞HSP70＞ACTR2＞GAPDH。

表3 取食對(duì)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of feeding on the stability of gene expression of candidate reference genes

2.3.3 農(nóng)藥處理對(duì)稻螟赤眼蜂內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響 不同農(nóng)藥處理中，Delta CT、NormFinder軟件分析均表明PABPC1L基因表達(dá)最穩(wěn)定，ACTR2基因表達(dá)最不穩(wěn)定。BestKeeper、GeNorm軟件分析表明CSNK1a1基因表達(dá)最穩(wěn)定，GAPDH基因表達(dá)不穩(wěn)定。不同的農(nóng)藥處理下，利用RefFinder分析軟件綜合分析，發(fā)現(xiàn) 10個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性從高到低依次是PABPC1L＞TMEM209＞CSNK1a1＞ARPC2＞EEF1D＞EF1a、SFRS7＞HSP70＞GAPDH＞ACTR2。綜合分析，不同的農(nóng)藥刺激下，稻螟赤眼蜂10個(gè)候選內(nèi)參基因中表達(dá)較為穩(wěn)定的3個(gè)內(nèi)參基因分別為PABPC1L、TMEM209和CSNK1a1（表4）。

表4 不同農(nóng)藥處理對(duì)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響Table 4 Effects of different pesticide treatments on the stability of gene expression of candidate reference genes

2.3.4 發(fā)育歷期對(duì)稻螟赤眼蜂內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響 在蛹期和成蟲(chóng)期收集的樣品中，Delta CT和NormFinder分析軟件結(jié)果表明PABPC1L基因表達(dá)最穩(wěn)定；BestKeeper分析結(jié)果表明SFRS7基因表達(dá)最穩(wěn)定；GeNorm分析ARPC2、EEF1D基因表達(dá)最穩(wěn)定。TMEM209基因在各分析軟件結(jié)果中，基因表達(dá)穩(wěn)定性均較差。利用 RefFinder分析軟件綜合分析，10個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性從高到低依次是PABPC1L＞ARPC2＞ACTR2＞EEF1D＞HSP70＞GAPDH＞SFRS7＞EF1a＞CSNK1a1＞TMEM209。綜合分析，在不同的發(fā)育歷期下，3個(gè)較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別是PABPC1L、ARPC2和ACTR2（表5）。

表5 不同發(fā)育歷期對(duì)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響Table 5 Effects of different developmental stages on the stability of gene expression of candidate reference genes

2.4 內(nèi)參基因配對(duì)變異值

MIQE指南指出，至少使用兩個(gè)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的內(nèi)參基因?qū)?qRT-PCR的結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[16]。本研究利用GeNorm分析計(jì)算配對(duì)變異值Vn/（n＋1）確定合適的內(nèi)參基因數(shù)量，當(dāng)變異值小于0.15時(shí)，則不需要增加額外的內(nèi)參基因來(lái)提高準(zhǔn)確性[17]。在本研究四種條件下，變異值均小于0.15（圖3），這表明2個(gè)內(nèi)參基因已經(jīng)足夠保證準(zhǔn)確性。

圖3 稻螟赤眼蜂內(nèi)參基因最優(yōu)數(shù)量分析Fig.3 Determination of the optimal number of reference genes in Trichogramma japonicum

3 討論

qRT-PCR技術(shù)具有高效、準(zhǔn)確、靈敏和易重復(fù)等特點(diǎn)，現(xiàn)該技術(shù)已成為基因表達(dá)分析的主要技術(shù)手段之一，但是其結(jié)果的準(zhǔn)確性是基于所選的表達(dá)穩(wěn)定性較高的內(nèi)參基因，未經(jīng)驗(yàn)證而使用先前發(fā)表的內(nèi)參基因可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差[17,18]。目前隨著稻螟赤眼蜂生物防治的再次被重視，對(duì)其生物分子的研究也越來(lái)越多。本研究通過(guò)Delta-Ct、NormFinder、geNorm和BestKeeper四種方法分別對(duì)溫度處理、飼養(yǎng)條件處理、藥劑處理以及不同的發(fā)育歷期的稻螟赤眼蜂進(jìn)行候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)估。四種方法計(jì)算得出10種候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排名存在差異，最后通過(guò)RefFinder分析軟件對(duì)該結(jié)果進(jìn)行綜合排序。

在本試驗(yàn)中，我們利用上述5種方法分別分析評(píng)估了PABPC1L、ACTR2、ARPC2、EF1a、EEF1D、SFRS7、HSP70、CSNK1a1、GAPDH和TMEM209這10種候選內(nèi)參基因在4種不同試驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性。其中ACTR2、ARPC2、EF1a、EEF1D、HSP70和GAPDH這6種基因是已經(jīng)報(bào)道在某些物種的研究中做為內(nèi)參基因使用的基因。ARPC2和ACTR2是肌動(dòng)蛋白相關(guān)復(fù)合體七個(gè)亞基其中之一[19]，肌動(dòng)蛋白對(duì)于細(xì)胞的移動(dòng)和收縮有著重要作用，在肌肉運(yùn)動(dòng)中也起重要作用。ARPC2最先是在棘阿米吧中發(fā)現(xiàn)，主要在組織的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞中表達(dá)[20]，參與細(xì)胞內(nèi)肌肉蛋白聚合的控制，在微絲的核化中起關(guān)鍵作用[21,22]。該基因在沙漠蝗Schistocerca gregaria研究腦內(nèi)基因表達(dá)時(shí)可作為內(nèi)參基因[23]，而在本研究中在不同發(fā)育歷期中表達(dá)較為穩(wěn)定。延伸因子即EF1a和EEF1D，通過(guò)催化氨?；D(zhuǎn)運(yùn)RNA的依賴型GTP結(jié)合到核糖體的受體位點(diǎn)，在翻譯過(guò)程中起著重要作用[24]。EF1在很多研究中，被認(rèn)為是合適的內(nèi)參基因，如斜紋夜蛾Spodoptera litura的溫度處理樣品[25]、東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis的不同發(fā)育歷期[26]、西花薊馬Frankliniella occidentalis的不同歷期和溫度處理[27]、大螟Sesamia inferens的不同組織和不同發(fā)育歷期[28]及瓢蟲(chóng)的不同發(fā)育時(shí)期和溫度處理[29]等。如在鮭魚(yú)[30]和直翅目[31,32]研究顯示EF1表達(dá)也較穩(wěn)定。與前人報(bào)道相似，本研究顯示EF1a和EEF1D可在溫度處理時(shí)做為內(nèi)參基因。HSP基因家族是與熱激相關(guān)的蛋白，在巴氏新小綏螨Neoseiulus barkeri的研究顯示Hsp60和Hsp90在殺螨劑的刺激下是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因[33]，但Hsp70并不適合做為內(nèi)參基因，該結(jié)果與本研究一致，Hsp70在供試條件下均不適合做為內(nèi)參基因。GAPDH在多個(gè)研究報(bào)道中顯示可以做為內(nèi)參基因使用，如在甜菜葉蛾Spodoptera exigua的不同發(fā)育歷期[34]、溫度脅迫下的黃翅娟野螟Diaphania caesalis[35]和不同光處理?xiàng)l件下的粘蟲(chóng)Mythimna separate[36]等。但也有不少物種與本研究的研究結(jié)果相似，GAPDH并不適合做為內(nèi)參基因，如在二化螟不同發(fā)育歷期、不同組織、溫度處理、殺蟲(chóng)劑處理、取食不同飼料、取食不同水稻和 dsRNA處理均不適合做為內(nèi)參基因[37]，在蜜蜂Frieseomelitta varia和Melipona quadrifasciata不同發(fā)育歷期、性別、組織以及細(xì)菌注射和農(nóng)藥處理的條件下都不適合做為內(nèi)參基因[38]。

雖然大部分的內(nèi)參篩選研究一般都會(huì)選擇已報(bào)道的內(nèi)參基因做為候選基因，但也有研究通過(guò)篩選未報(bào)道的候選基因篩選到了更合適的內(nèi)參基因。Xie等[39]在通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)了ZFP268可以做為螟黃赤眼蜂Trichogramma chilonis在不同食物和不同溫度處理下的內(nèi)參基因，而在此前并未有ZFP268可以做為內(nèi)參基因的報(bào)道。在本試驗(yàn)中，除了選擇了常用的看家基因作為候選內(nèi)參基因外，我們還根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)選擇了幾種在熱激條件下穩(wěn)定表達(dá)但未報(bào)道做為內(nèi)參基因的4種候選基因，包括TMEM209、PABPC1L、SFRS7和CSNK1a1，希望能從中篩選出合適的內(nèi)參基因。結(jié)果顯示，盡管CSNK1a1并不是合適的內(nèi)參基因，但PABPC1L和TMEM209是農(nóng)藥處理下表達(dá)最穩(wěn)定的基因，PABPC1L同時(shí)還是不同發(fā)育歷期中表達(dá)最穩(wěn)定的基因，而SFRS7則是取食不同食物后表達(dá)最為穩(wěn)定的基因。因此，在本次研究中我們共篩選到了3種未曾報(bào)道過(guò)的內(nèi)參基因，這也提示了我們?cè)诮窈髢?nèi)參基因的篩選中可以適當(dāng)?shù)財(cái)U(kuò)大篩選范圍，從而發(fā)現(xiàn)一些更為合適的內(nèi)參基因。

本研究中，我們利用了5種方法評(píng)估了10個(gè)候選內(nèi)參基因在不同條件下的表達(dá)穩(wěn)定性。其中溫度處理下，EF1a基因表達(dá)最穩(wěn)定；取食條件不同時(shí)，SFRS7基因表達(dá)最穩(wěn)定；而在農(nóng)藥處理和不同發(fā)育歷期時(shí)，PABPC1L基因表達(dá)最為穩(wěn)定。因此，我們的試驗(yàn)表明沒(méi)有通用的穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，不同的試驗(yàn)條件下應(yīng)該選擇適合該條件下的內(nèi)參基因。本研究結(jié)果為在不同條件下選擇稻螟赤眼蜂內(nèi)參基因提供了參考，也有利于在稻螟赤眼蜂的基因表達(dá)研究中取得更為可靠、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。