龐凱悅，柴沙駝，王 迅，孫 璐，崔占鴻，劉書(shū)杰，王書(shū)祥，楊英魁

（青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 / 青海省高原放牧家畜營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 青海省牦牛工程技術(shù)研究中心, 青海 西寧 810016）

反芻動(dòng)物的瘤胃內(nèi)棲息著細(xì)菌、真菌和原蟲(chóng)等多種微生物[1]。瘤胃微生物可降解飼料產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)和氨態(tài)氮(NH3-N)，并合成微生物蛋白(microbial protein, MCP)為反芻動(dòng)物提供主要蛋白質(zhì)來(lái)源，對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能及健康至關(guān)重要[2-3]。瘤胃微生物菌群是反芻動(dòng)物消化系統(tǒng)的重要組成部分，影響瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的因素有飼糧組成、動(dòng)物年齡及健康狀況等，其中飼糧組成是調(diào)控瘤胃菌群結(jié)構(gòu)及發(fā)酵活動(dòng)的主要因素[4]。研究表明，提高飼糧的精料水平顯著提高了荷斯坦?fàn)倥Ａ鑫敢褐斜?、丁酸和氨態(tài)氮的濃度，但顯著降低了纖維分解菌(纖維桿菌屬、琥珀酸單胞菌屬)的豐度[5]。Li 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼糧中精料水平的提高，綿羊瘤胃中淀粉降解菌和蛋白質(zhì)降解菌的相對(duì)豐度呈線性下降趨勢(shì)。因此，飼糧中適宜的精料水平可以提高反芻動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用[7]，但在實(shí)際生產(chǎn)中，飼糧精粗比過(guò)高或過(guò)低均會(huì)改變反芻動(dòng)物瘤胃微生物的結(jié)構(gòu)與功能，進(jìn)而影響?zhàn)B殖的經(jīng)濟(jì)效益。目前，飼糧精粗比對(duì)奶牛、山羊及其他反芻動(dòng)物瘤胃微生物的調(diào)控研究已有大量的報(bào)道[8-11]；但是，有關(guān)飼糧精粗比對(duì)牦牛瘤胃微生物影響的研究報(bào)道較少，在早期階段，青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)課題組研究了飼糧精粗比對(duì)育肥牦牛生長(zhǎng)性能的影響，結(jié)果表明，適宜的飼糧精粗比能提高牦牛的生長(zhǎng)性能和養(yǎng)殖收益[12]，這可能與不同精粗比飼糧對(duì)牦牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響有關(guān)，因此，本研究旨在通過(guò)16s rDNA高通量測(cè)序技術(shù)，探討飼糧精粗比對(duì)牦牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響，為牦牛的合理飼養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2019 年9 月在青海省貴南縣老扎西養(yǎng)殖基地進(jìn)行。選擇體重(164.9 ± 12.9) kg、體況良好的雄性牦牛36 頭，隨機(jī)分為3 組，每組12 頭，飼糧精粗比分別為50 ∶ 50 (A 組)、65 ∶ 35 (B 組)和80 ∶ 20(C 組)的全混合日糧。試驗(yàn)期共105 d，其中預(yù)試期15 d，正試期90 d。每日08:00 和17:00 飼喂，飼草自由采食，自由飲水，各組間飼養(yǎng)方式及環(huán)境一致。試驗(yàn)飼糧設(shè)計(jì)參考《肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 815-2004)[13]，試驗(yàn)飼糧的組成及營(yíng)養(yǎng)成分如表1 所列。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diets (dry matter basis)

1.2 樣品采集

在試驗(yàn)期間，每30 d 收集一次試驗(yàn)飼糧，裝于密封袋中，并在-20 ℃下儲(chǔ)存以供測(cè)試。在試驗(yàn)最后1 d，每組隨機(jī)選取6 頭牦牛，于晨飼前，使用胃管式采樣器采集每頭牦牛150 mL 瘤胃液，4 層無(wú)菌紗布過(guò)濾后測(cè)定pH，剩余樣品分裝至15 mL 離心管中，放入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室并置于-80 ℃超低溫冰箱保存待測(cè)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.3.1 試驗(yàn)飼糧營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

干物質(zhì)(dry matter, DM)、粗蛋白質(zhì)(crude protein,CP)、鈣(calcium, Ca)、磷(phosphorus, P)含量分別采用GB/T 6435-2014[14]、GB/T 6432-2018[15]、GB/T 6436-2002[16]和GB/T 6437-2002[17]中 的 方 法 測(cè)定。中性洗滌纖維 (neutral detergent fibres, NDF) 、酸性洗滌纖維 (acid detergent fibres, ADF) 含量采用Van 等[18]的方法測(cè)定。

1.3.2 DNA 提取、測(cè)序和分析

使用十六烷基三甲基溴化銨法(cetyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)方法從瘤胃液樣本中提取細(xì)菌DNA，通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估DNA的質(zhì)量。PCR 采用25 μL 擴(kuò)增體系。用QIAquickPCR純化試劑盒(德國(guó)Qiagen 公司)純化回收，瘤胃液樣品送至北京奧維森基因科技有限公司分析，測(cè)序平臺(tái)Mixed PE 300。

測(cè)序平臺(tái)得到的原始數(shù)據(jù)采用trimmomatic(Version 0.36)軟件進(jìn)行處理和低質(zhì)量數(shù)據(jù)過(guò)濾，通過(guò)vsearch 軟件去除嵌合體，得到有效序列。對(duì)相似性大于97% 以上的序列進(jìn)行篩選，生成OUTs 序列，并對(duì)OTU 聚類與注釋進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)QIIME 2 (version 1.9.0)計(jì)算α 多樣性，Bray-Curtis 相異矩陣和QIIME 2 的主坐標(biāo)分析(PCoA)用于分析各處理組細(xì)菌群落的差異。線性判別分析效應(yīng)大小(LEfSe，LDA ＞ 3)用于識(shí)別兩組中的重要細(xì)菌。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SAS 9.2 統(tǒng)計(jì)軟件的正交多項(xiàng)式分析和Duncan’s多重比較，對(duì)各處理組的α 多樣性指數(shù)、瘤胃細(xì)菌門和屬水平菌群的相對(duì)豐度進(jìn)行單因素方差分析、線性和二次趨勢(shì)擬合，P＜ 0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧精粗比對(duì)牦牛瘤胃細(xì)菌豐富度和多樣性的影響

3 個(gè)試驗(yàn)組牦牛瘤胃液細(xì)菌測(cè)序共獲得操作分類單元(OTU) 3 354 個(gè)(圖1)，其中共有的OTU 是1 851 個(gè)，占總OTU 數(shù)目的55.19%，試驗(yàn)A、B 和C 組的OTU 數(shù)目分別為2 817、2 590 和2 437 個(gè)，相對(duì)應(yīng)的獨(dú)有OTU數(shù)目分別為369、161 和185 個(gè)。通過(guò)α 多樣性分析(表2)可知，隨著飼糧精粗比的提高，牦牛瘤胃液細(xì)菌的物種數(shù)、Chao1 指數(shù)、Shannon指數(shù)及譜系多樣性顯著線性降低(P＜ 0.05)，各組的覆蓋率均大于99.5%，這表明測(cè)序程度覆蓋了樣品中99.5% 以上的細(xì)菌種類?；赨niFrac 的未加權(quán)的PCoA 分析可知第一成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為28.29% 和16.76%，各處理組細(xì)菌結(jié)構(gòu)能夠明顯分開(kāi)(圖2)。

圖1 OTU 韋恩圖Figure 1 OTU Venn diagram

圖2 PCoA 分析Figure 2 Principal coordinate analysis

表2 飼糧精粗比對(duì)牦牛瘤胃細(xì)菌alpha 多樣性的影響Table 2 Effect of ration concentrate to roughage ratios on the alpha diversity of rumen bacteria in yaks

2.2 飼糧精粗比對(duì)牦牛瘤胃細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成的影響

在門水平上，牦牛瘤胃優(yōu)勢(shì)菌為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes) 和放線菌門(Actinobacteria) (表3)。牦牛瘤胃的厚壁菌門和放線菌門相對(duì)豐度隨著飼糧精粗比的增加呈顯著線性提高(P＜ 0.05)，而擬桿菌門的相對(duì)豐度顯著線性下降(P＜ 0.05)。試驗(yàn)B 組的疣微菌門(Verrucomicrobia)相對(duì)豐度顯著高于其他兩組(P＜ 0.05)。在屬水平上，牦牛瘤胃優(yōu)勢(shì)菌屬為普雷沃菌屬_1 (Prevotella_1)、理研菌科RC9 屬 (Rikenellaceae_RC9_ gut_group)、克里斯滕森菌科R-7 菌屬 (Christensenellaceae_R-7_group)和 瘤 胃 球 菌 科NK4A214 菌屬(Ruminococcaceae_NK4A214_group) 等(表4)。隨著飼糧精粗比的提高，牦牛瘤胃中普雷沃菌屬_1、瘤胃球菌科NK4A214 菌屬(Ruminococcaceae_NK4A214_group)和聚乙酸菌屬(Acetitomaculum)的相對(duì)豐度呈顯著線性提高(P＜ 0.05)，而瘤胃球菌屬_2 (Ruminococcus_2)和毛螺菌科NK3A20 菌屬(Lachnospiraceae_NK3A20_group)的相對(duì)豐度呈顯著線性降低(P＜ 0.05)。

表3 門水平下飼糧精粗比對(duì)牦牛瘤胃細(xì)菌群落組成(相對(duì)豐度)的影響Table 3 Effect of ration concentrate to roughage ratio on the composition of rumen bacterial communities(relative abundance) in yaks, phylum level%

表4 屬水平下飼糧精粗比對(duì)牦牛瘤胃細(xì)菌群落組成(相對(duì)豐度)的影響Table 4 Effect of ration concentrate to roughage ratio on the composition of rumen bacterial communities(relative abundance) in yaks, genus level%

2.3 飼糧精粗比對(duì)牦牛組間差異LEFse 分析

瘤胃球菌科NK4A214 菌屬(Ruminococcaceae_NK4A214_group)、聚乙酸菌屬(Acetitomaculum)、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia)、Paeniclostridium、疣微菌門下的LD1-PB3在C 組中相對(duì)豐度較高。WCHB1-41、厭氧棍狀菌屬(Anaerotruncus)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、艱難桿菌屬(Mogibacterium) 在B 組中相對(duì)豐度最高。瘤胃球菌屬_2、奎因氏菌屬(Quinella)、酸氨基球菌科(Acidaminococcaceae) 在A 組中相對(duì)豐度較高(圖3、圖4)。

圖3 基于分類信息的線性判別分析效應(yīng)大小分類圖Figure 3 Linear discriminant analysis effect size cladogram based on classification information

圖4 基于分類信息的線性判別分析得分直方圖Figure 4 Histogram of linear discriminant analysis scores based on classification information

3 討論

3.1 飼糧精粗比對(duì)牦牛瘤胃細(xì)菌豐富度和多樣性的影響

16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)可以深入了解飼糧精粗比對(duì)牦牛瘤胃菌群的影響[19]。Kumar 等[20]研究表明，飼糧精料水平由20%提高至50%顯著降低了產(chǎn)后荷斯坦奶牛瘤胃細(xì)菌的豐富度與多樣性。劉玉潔[21]研究了高精料飼糧對(duì)山羊瘤胃微生物的影響，結(jié)果表明：低精料組山羊瘤胃微生物的多樣性顯著高于高精料組。本研究中，隨著飼糧精粗比的提高，牦牛瘤胃細(xì)菌的物種數(shù)、Chao1 指數(shù)、Shannon指數(shù)及譜系多樣性呈顯著線性降低，與上述研究結(jié)果一致。這可能與瘤胃液pH 的降低有關(guān)。精料中的碳水化合物含量較粗料高，高比例精料會(huì)導(dǎo)致瘤胃乳酸含量升高，并導(dǎo)致pH 降低[22]，進(jìn)而會(huì)抑制瘤胃內(nèi)相關(guān)纖維降解菌的生長(zhǎng)與定殖[5,23]，從而降低了細(xì)菌的豐富度。以上結(jié)果說(shuō)明，瘤胃液pH 與瘤胃細(xì)菌的多樣性和豐富度息息相關(guān)[24]，過(guò)多提高飼糧精粗比會(huì)降低瘤胃細(xì)菌的多樣性與豐富度。

3.2 飼糧精粗比對(duì)牦牛瘤胃細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成的影響

飼糧組成是影響反芻動(dòng)物瘤胃細(xì)菌結(jié)構(gòu)與多樣性的主要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，肉牛瘤胃細(xì)菌的主要菌門是厚壁菌門和擬桿菌門，其數(shù)量占整個(gè)細(xì)菌門水平的80%以上[25-26]。據(jù)報(bào)道，厚壁菌門主要參與結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解，而擬桿菌門主要參與非纖維物質(zhì)的降解，兩者對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵至關(guān)重要[27]。本研究中，不同精粗比飼糧處理下，牦牛瘤胃內(nèi)的厚壁菌門和擬桿菌門相對(duì)豐度最高，為優(yōu)勢(shì)菌，與以上研究結(jié)果一致。林波等[28]研究表明，0 ∶ 100、35 ∶ 65 和50 ∶ 50 3 種 精 粗 比 飼 糧 飼 喂 泌 乳 期 水 牛，全粗料組水牛瘤胃內(nèi)擬桿菌門的相對(duì)豐度顯著高于其他兩組，而厚壁菌門的相對(duì)豐度顯著低于其他兩組。Fernando 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃內(nèi)擬桿菌門的相對(duì)豐度與飼糧精料水平成反比，與厚壁菌門的相對(duì)豐度成正比。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果相似，原因可能是擬桿菌門大部分細(xì)菌屬于革蘭氏陰性菌，瘤胃液pH 降低會(huì)導(dǎo)致革蘭氏陰性菌死亡或裂解，最終導(dǎo)致擬桿菌門的相對(duì)豐度下降，而厚壁菌門相對(duì)豐度則相應(yīng)上升[30]。放線菌門屬于類革蘭氏陽(yáng)性菌，大多數(shù)為腐生菌和寄生菌，可引起疾病[31]。本研究中，80%精料飼糧組牦牛瘤胃內(nèi)放線菌門的相對(duì)豐度高于其他兩組，這與王書(shū)祥等[32]和占今舜等[9]的研究結(jié)果相似，表明牦牛飼糧精粗比不宜過(guò)高。疣微菌門含有多種糖苷水解酶，在動(dòng)物機(jī)體的胃腸道消化屏障作用、代謝炎癥和免疫耐受方面發(fā)揮著重要作用[33-34]。本研究中，隨著飼糧精粗比的提高，牦牛瘤胃的疣微菌門先增加后減少，且80%精料飼糧組牦牛瘤胃的疣微菌門豐富度低于50%精料飼糧組，這表明80%精料飼糧組的牦?？赡芴幱谝环N亞健康狀態(tài)。

本研究表明，在屬水平上，普雷沃菌屬_1、理研菌科RC9 屬和克里斯滕森菌科R-7 菌屬是牦牛瘤胃細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群，這與Anderson 等[35]研究結(jié)果相一致。普雷沃菌屬對(duì)半纖維素、果膠、淀粉和蛋白質(zhì)降解至關(guān)重要[36-37]。Zhang 等[38]研究發(fā)現(xiàn)高精料組山羊瘤胃內(nèi)細(xì)菌相對(duì)豐度較高的是普雷沃菌屬。高雨飛[39]研究表明，提高飼糧中精料比例顯著促進(jìn)了錦江牛瘤胃普雷沃菌屬的生長(zhǎng)與定殖。本研究中，牦牛瘤胃普雷沃菌屬_1 的豐度與飼糧精粗比呈正相關(guān)，這可能與高精料飼糧中淀粉含量較高有關(guān)。瘤胃球菌科NK4A214 菌屬是厚壁菌門中的一種革蘭氏陰性菌，能夠利用或降解飼糧中不易降解的纖維和多糖[40]。有研究表明，瘤胃球菌科NK4A214 菌屬豐度與宿主飼料利用率和瘤胃液VFA的代謝呈正相關(guān)關(guān)系[41]。本研究中，隨著飼糧精粗比的提高，牦牛瘤胃中瘤胃球菌科NK4A214 菌屬豐度呈顯著線性提高，這與Cui 等[42]研究一致。張雪嬌和王立志[43]研究發(fā)現(xiàn)，山羊瘤胃中瘤胃球菌屬_2的豐度隨飼糧NDF 水平提高而升高，本研究結(jié)果與其相似，表明提高精飼料攝入量可抑制牦牛瘤胃中某些纖維降解菌的生長(zhǎng)。有研究表明，毛螺菌科具有很強(qiáng)的纖維素分解活性，能夠降解宿主難以消化的植物纖維素和半纖維素，其豐度與飼糧中纖維的含量正相關(guān)[44-45]。本研究中，65% 精料飼糧和80%精料飼糧的毛螺菌科NK3A20 菌屬的豐度顯著低于50%精料飼糧組的，表明提高飼糧精粗比抑制了其在牦牛瘤胃中的生長(zhǎng)，與Li 等[46]的研究結(jié)果一致。Koike 和Kobayashi[47]研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃聚乙酸菌屬可以利用單糖產(chǎn)生丙酸，當(dāng)飼喂高精料飼糧時(shí)，有助于合成更多的丙酸。本研究中，80%精料飼糧組的聚乙酸菌屬豐度顯著高于50%精料飼糧，青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)課題組前期研究瘤胃液發(fā)酵參數(shù)中丙酸的變化趨勢(shì)也側(cè)面驗(yàn)證這一點(diǎn)[12]。

4 結(jié)論

在本研究條件下，隨著飼糧精粗比的提高，瘤胃細(xì)菌的多樣性與豐富度降低，降低了部分纖維相關(guān)降解菌的豐度；并且過(guò)高比例(80%)的精料飼糧，會(huì)抑制部分瘤胃微生物活性，不利于牦牛健康生長(zhǎng)。