顧玲 綜述 魏霄瀅，衡偉 審校

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 蘇州 215000

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤，晚期肺癌的5年生存率僅6%[1]。根據(jù)病理類型，可將肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC占總病例的85%以上[2]。盡管NSCLC治療層出不窮，存在經(jīng)典驅(qū)動基因突變的患者可口服靶向藥物治療，PD-1抑制劑為基因突變野生型患者帶來長生存希望[3]。但是仍有部分患者既無可選擇的靶向藥物，也不能從程序性死亡受體1(programmed death 1，PD-1)/程序性死亡-配體1(Programmed cell death-ligand 1，PD-L1)抑制劑中獲益，傳統(tǒng)化療療效有限。因此，可選擇的新的治療方式對這部分患者至關(guān)重要。

嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)-T細胞治療是過繼免疫療法(adoptive cell therapy，ACT)之一。通過體外合成的工程化CAR修飾T細胞，使其能夠靶向特定腫瘤抗原、識別腫瘤細胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)擴增后輸注體內(nèi)，可達到腫瘤個體化治療效果。以CD19為靶點的第二代CAR-T細胞已被批準用于淋巴瘤和慢性粒細胞白血病的治療[4]。實體瘤中，多項臨床前研究發(fā)現(xiàn)CAR-T治療有效，包括肺癌[5]、乳腺癌[5]、惡性間皮瘤[6]、惡性黑色素瘤[7]等。

1 CAR-T細胞結(jié)構(gòu)

CAR-T細胞是工程化T細胞，其通過表達特異性載體CAR識別并清除腫瘤細胞。CAR是一種人工合成蛋白，由細胞外的抗原結(jié)合域、鉸鏈區(qū)，跨膜域和細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[8]。CAR-T細胞通過胞外抗原結(jié)合域中的單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)與靶細胞表面抗原結(jié)合，從而介導(dǎo)MHC非限制性腫瘤細胞殺傷[9]。鉸鏈區(qū)可增加CART細胞的遷移能力[10]。胞內(nèi)的信號結(jié)構(gòu)域是一種細胞內(nèi)T細胞激活復(fù)合物，其通過調(diào)節(jié)T細胞活化的下游信號級聯(lián)觸發(fā)抗原結(jié)合，通常包括一個激活結(jié)構(gòu)域和一個或多個共刺激結(jié)構(gòu)域[11]。CAR可分為五代，主要差異在胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域，一代胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含CD3ζ，二代包含CD3ζ和一個共刺激分子，三代包含CD3ζ和兩個共刺激結(jié)構(gòu)域，四代較其他不同的是加入一段活化T細胞的核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)結(jié)構(gòu)域，五代在二代的基礎(chǔ)上加入一段IL-2受體β(IL-2Rβ)[8，12]。

2 NSCLC相關(guān)靶抗原

理想的靶抗原應(yīng)該具有高覆蓋率、高特異性及高度穩(wěn)定，即該抗原為多數(shù)腫瘤細胞所表達且基本只存在腫瘤細胞表面，并且穩(wěn)定存在[13]。不同實體瘤表達的腫瘤抗原有差異，NSCLC靶向抗原目前研究較多的是受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1)、PD-1/PD-L1、間皮素(mesothelin，MSLN)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)。

2.1 ROR1 ROR1是受體酪氨酸激酶樣孤兒受體家族成員之一，在部分卵巢癌、三陰乳腺癌、肺癌中表達，且不在正常成人重要組織，如心、肺、腦、肝臟中表達[14]。NSCLC中，肺腺癌表達ROR1陽性率最高(ROR1+為42%)，鱗癌ROR1+占12%[14]。因此ROR1被認為可作為NSCLC CAR-T治療靶點。在NSCLC 3D腫瘤模型中，有研究發(fā)現(xiàn)ROR1 CAR-T細胞可消除肺癌的大3D腫塊[5]。然而在一項Ⅰ期臨床試驗(NCT02706392)中，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者輸注表達ROR1 CAR的自體CD4+和CD8+T細胞后，外周血中能檢測到CAR-T細胞擴增，但腫瘤組織中CAR-T細胞浸潤不佳，同時CAR-T細胞上調(diào)多種抑制性受體，且不產(chǎn)生γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、粒細胞單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)等抗腫瘤因子，最終未觀察到實體腫瘤的消退[15]。盡管體外實驗效果喜人，但在臨床試驗中并未取得陽性結(jié)果，如何使ROR1 CAR-T細胞在人體中發(fā)揮其殺傷腫瘤的作用仍需進一步研究。

2.2 PD-1/PD-L1 PD-1/PD-L1通 路 是T細 胞轉(zhuǎn)歸和功能的重要調(diào)節(jié)器[16]，PD-1/PD-L1結(jié)合可抑制T細胞活化，使腫瘤逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。針對PD-1/PD-L1信號通路的藥物在NSCLC中顯示良好的療效[17]。目前臨床上最常見的是免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)，其通過靶向PD-1/PD-L1通路，破壞T細胞活化抑制信號，從而使細胞毒性T細胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)重新識別和清除腫瘤[18]。而靶向PD-1/PD-L1的CART治療正在研究中。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞上PD-L1可與CAR T細胞上的PD-1結(jié)合，從而影響CAR-T細胞介導(dǎo)的體內(nèi)外清除和殺傷腫瘤的能力，通過CRISPR/Cas9技術(shù)破壞T細胞上的PD-1，制備的CART細胞具有更好的治療效果[16]。另外，QIN等[19]設(shè)計了一種包含針對人PD-L1的高親和力單鏈可變抗體的抗PD-L1 CAR-T細胞，即CARPD-L1z T細胞，在體外實驗中觀察到CARPD-L1z T細 胞 能 分 泌 大 量IL-2、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α，并在NSCLC小鼠模型中兩次輸注CARPD-L1z T細胞后觀察到腫瘤生長減慢。因此，除了ICIs，靶向PD-1/PD-L1的CAR T細胞治療也有可能在肺癌免疫治療中占一席之地。

2.3 MSLN MSLN除了在腹膜、胸膜腔、心包的間皮細胞上低表達，其他大多數(shù)人體正常組織中檢測不到[20]，但在肺癌中高表達(60%～70%)[21]，因此被當(dāng)作CAR-T細胞 治 療 的 靶 點。YE等[22]將CAR-T MSLN細胞通過尾靜脈輸注腫瘤小鼠模型，發(fā)現(xiàn)靶向MSLN的第二代CAR T細胞可以抑制腫瘤生長，且隨著效應(yīng)靶比(effector to target ratio)的升高，抗腫瘤效果進一步增強。WANG等[23]進一步將CCR2b與MSLN-CAR共表達，制備CCR2b-MSLN-CAR-T細胞，發(fā)現(xiàn)CCR2b-MSLN-CAR-T細胞有強大的細胞毒作用并產(chǎn)生高水平的促炎細胞因子；另外將CCR2b-MSLN-CAR-T細胞輸注于NSCLC CDX(cell line-derived xenograft，CDX)模型中，通過IHC分析發(fā)現(xiàn)CCR2b-MSLNCAR-T細胞與傳統(tǒng)MSLN-CAR-T細胞相較，其向腫瘤組織遷移、浸潤能力更強。盡管間皮素在正常組織中存在表達，但兩例輸注靶向MSLN的CAR-T細胞后未出現(xiàn)腹膜炎等靶向/非腫瘤毒性[24]，需進一步擴大樣本量證實其安全性。

2.4 EGFR基因擴增和突變導(dǎo)致EGFR過表達，促進腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、血管新生，特別是NSCLC，其是NSCLC治療的有效靶點之一[25]，因此，NSCLC也被認為可受益于EFGR CAR-T細胞免疫治療。不少臨床前研究發(fā)現(xiàn)EGFR CAR-T細胞在NSCLC中的抗腫瘤活性。LI等[26]發(fā)現(xiàn)EGFR CAR-T細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)后細胞毒性T細胞顯著擴增、EGFR CAR-T細胞也持續(xù)增殖，體外試驗進一步發(fā)現(xiàn)EGFR CAR-T細胞的特異性裂解活性、促進細胞因子分泌作用及CAR-T細胞數(shù)的增加；在小鼠模型中，觀察到EGFR CAR-T細胞顯著降低了腫瘤負擔(dān)，且未觀察到肺、心、肝、脾和腎等非腫瘤組織的的毒性反應(yīng)。LI等[27]發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血漿中CXCL13水平遠高于健康對照組，且在肺癌組織中水平高于正常組織，CXCR5是CXCL13的唯一受體，基于此，構(gòu)建了第二代CXCR5-EGFR-CAR-T細胞，并在體外試驗和小鼠試驗中觀察到搭載了CXCR5的EGFR-CAR-T細胞較經(jīng)典EGFR-CAR-T細胞向CXCL13陽性的腫瘤組織遷移作用增強，且對CXCL13陽性的腫瘤組織殺傷力增強。最近的一項Ⅰ期臨床試驗(NCT03182816)證明了EGFR-CAR-T細胞治療EGFR陽性晚期復(fù)發(fā)/難治性NSCLC的有效性和安全性，疾病控制率為77.8%(7/9)，沒有出現(xiàn)4級不良事件[28]，期待大樣本數(shù)據(jù)進一步證實。

3 聯(lián)合化療增強CAR-T治療的抗腫瘤療效

含奧沙利鉑(oxaliplatin，Ox)聯(lián)合化療被認為可以誘導(dǎo)和維持免疫原性，刺激機體免疫應(yīng)答，加強抗腫瘤效應(yīng)[29]。SRIVASTAVA等[15]通過分析經(jīng)奧沙利鉑/環(huán)磷酰胺(oxaliplatin/cyclophosphamide，Ox/Cy)處理的小鼠肺腫瘤的基因，發(fā)現(xiàn)參與內(nèi)皮細胞炎癥、固有免疫細胞激活和干擾素信號的相關(guān)基因顯著上調(diào)，表明腫瘤微環(huán)境整體向促炎癥狀態(tài)轉(zhuǎn)變，證明奧沙利鉑用于肺腫瘤也可誘導(dǎo)免疫原性細胞殺傷；同時，CAR-T細胞聯(lián)合Ox/Cy治療顯著增強腫瘤中CAR-T細胞的積聚，抗腫瘤效果優(yōu)于單CAR-T治療，且未發(fā)現(xiàn)聯(lián)合Ox/Cy對正常組織的影響增強。

4 CAR T細胞免疫治療的挑戰(zhàn)

4.1 腫瘤免疫抑制微環(huán)境腫瘤微環(huán)境主要由癌細胞、免疫細胞(包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞、髓源性抑制細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞)、細胞因子、癌癥相關(guān)成纖維細胞(CAFs)和細胞外基質(zhì)構(gòu)成，其中髓源性抑制細胞和M2表型腫瘤相關(guān)巨噬細胞起主要免疫抑制作用[30]；腫瘤細胞和髓樣細胞通過表達大量吲哚胺2,3二氧化酶(Indoleamine 2,3 dioxygenase，IDO)催化色氨酸降解為犬尿氨酸，犬尿氨酸的大量累積抑制CAR-T細胞的擴增、細胞毒性和細胞因子分泌；成纖維細胞和基質(zhì)細胞通過分泌生長因子、趨化因子，促進腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和血管生成[12]。另外，缺氧、營養(yǎng)缺乏的腫瘤微環(huán)境抑制正常細胞的功能，但癌細胞可以通過積累代謝相關(guān)基因突變，使其優(yōu)先攝取或攝取非常規(guī)來源的葡萄糖和氨基酸，以維持自身生長、增殖，并利用選擇性代謝物影響正常細胞功能[31]。腫瘤微環(huán)境的各組成成分從物理屏障、體液免疫、代謝等多方面限制了CAR-T細胞在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用。

4.2 CAR-T細胞衰竭T細胞衰竭是在癌癥中出現(xiàn)的一種T細胞功能障礙狀態(tài)，可表現(xiàn)為功能失調(diào)、抑制性受體持續(xù)表達及不同于效應(yīng)T細胞或記憶T細胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，失去對癌細胞的控制能力(T cell exhaustion)。類似的，CAR-T細胞衰竭也在許多臨床研究中被報道，一代CAR-T細胞對實體瘤無效。LONG等[32]進一步研究發(fā)現(xiàn)tonic CAR CD3ζ的磷酸化在CAR-T細胞衰竭中起核心作用，預(yù)示CAR-T細胞較T細胞更易出現(xiàn)衰竭。另外一些基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)CAR共刺激分子CD28、c-Jun(一種典型的AP-1因子)缺陷、E3泛素連接酶Cbl-b介導(dǎo)T細胞衰竭，從而影響CAR-T細胞抗腫瘤效力[32-34]。

4.3 CAR-T細胞治療的毒性反應(yīng)CAR-T細胞治療毒性發(fā)生機制可分為兩個方面，一方面來自T細胞活化、細胞因子釋放所致的全身毒性反應(yīng)，常見的是細胞因子釋放綜合征(cytokine-release syndrome，CRS)，可表現(xiàn)為血清炎癥性細胞因子水平升高、發(fā)熱、低血壓、缺氧和器官功能障礙[11]，與細胞治療存在合理的時間關(guān)系，但較少出現(xiàn)在細胞治療14 d以后[35]；CRS治療上常使用IL-6受體單克隆抗體Tocilizumab來打破細胞因子的反饋回路，皮質(zhì)類固醇也經(jīng)常與托西利珠單抗聯(lián)合使用[36]。另外較少見的全身性毒性反應(yīng)有免疫效應(yīng)細胞相關(guān)性神經(jīng)毒性(immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS)和嗜血細胞性淋巴細胞增多癥(haemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH)[11]。另一方面是CAR針對人體正常組織/非惡性腫瘤的靶抗原產(chǎn)生的毒性，稱為靶向/非腫瘤效應(yīng)[11]。尚未發(fā)現(xiàn)僅在腫瘤細胞生長上表達，且不在正常人體組織中表達的抗原，故在CAR-T細胞針對腫瘤細胞殺傷的同時，也會有正常人體組織損傷[37]。一項靶向抗羧基脫水酶IX(CAIX)的CAR-T細胞治療轉(zhuǎn)移性腎細胞癌試驗中，發(fā)生2～4級肝酶升高，肝活檢提示CAIX在膽管上皮上表達，伴有CAR-T細胞浸潤，提示CAIX靶向CAR T細胞在體內(nèi)產(chǎn)生抗正常組織上抗原的靶向效應(yīng)，出現(xiàn)肝毒性[38]。另外有病例報道，靶向ERBB2的CAR-T細胞在治療一例轉(zhuǎn)移性肺癌后15 min出現(xiàn)呼吸窘迫，40 min后胸片提示肺水腫，繼而出現(xiàn)嚴重低血壓、心跳驟停，5 d后死亡[39]。該病例中檢測到肺組織ERBB2的表達，故考慮是T細胞攻擊肺組織出現(xiàn)的不良事件。但目前CAR-T治療用于實體瘤的臨床數(shù)據(jù)較少，無法統(tǒng)計相關(guān)靶器官的毒性。

5 總結(jié)

盡管非小細胞肺癌的CAR-T細胞免疫治療正處在臨床前研究及一期臨床試驗階段，仍存在許多問題亟待解決。尋找特異性靶向NSCLC腫瘤細胞而腫瘤外毒性可忽略的CAR-T治療靶點至關(guān)重要；通過聯(lián)合治療、多靶點修飾等方式加強CAR-T細胞浸潤至腫瘤部位，增強抗腫瘤療效。雖然困難重重，但是隨著腫瘤治療逐漸傾向個體化，工程化CAR-T細胞治療仍是一種極具潛力的治療方式，有望在肺癌個體化治療中發(fā)揮作用。