林月霞,呂玉華,廖榮榮

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106)

加快發(fā)展肉羊產(chǎn)業(yè),對促進(jìn)現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展、提高農(nóng)民收入和改善居民肉類消費(fèi)結(jié)構(gòu)具有重要意義。近年來,羊育種由注重生長性狀向兼顧生長性狀和肉質(zhì)性狀等多元化方向發(fā)展,特別是優(yōu)質(zhì)、專門化新品種(系)培育已成為現(xiàn)代羊育種創(chuàng)新的重點(diǎn)。 近年來,國內(nèi)外已培育出多個肉羊新品種,如中國的南江黃羊、美國的波利帕羊、英國的劍橋羊、澳大利亞的道美羊和法國的夏洛來肉羊等。

良種是肉羊生產(chǎn)發(fā)展的基礎(chǔ),加快培育優(yōu)質(zhì)肉用優(yōu)良品種是提高羊肉產(chǎn)量的重要前提,而目前利用現(xiàn)代育種技術(shù),通過雜交創(chuàng)新將不同品種的優(yōu)良性狀聚合在一起是現(xiàn)代家畜新品種選育的主導(dǎo)方向。 加快羊優(yōu)質(zhì)新品種(品系)培育,需堅(jiān)持常規(guī)育種、分子育種與雜交育種相結(jié)合[1]。 對數(shù)量性狀的選擇主要有兩種方法:第一種是以表型剖析為基礎(chǔ)的常規(guī)育種方法,該方法雖能取得一定的遺傳進(jìn)展,但前提是需要對每個世代大量個體的表型進(jìn)行準(zhǔn)確判斷,這嚴(yán)重影響了選育的進(jìn)展和準(zhǔn)確性;第二種方法是借助分子標(biāo)記的輔助選擇育種法,此法可以較好解決第一種方法存在的問題[2]。 隨著分子育種技術(shù)的發(fā)展以及綿羊和山羊基因組的完善,FecB、CLPG、MSTN 等重要基因相繼被鑒定[3-5],并應(yīng)用于羊的分子標(biāo)記輔助選擇育種。 隨著高密度SNP(單核苷酸多態(tài)性)芯片的研制推廣,澳大利亞和英國等養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達(dá)國家先后建立起較大規(guī)模的基因組選擇參考群體,并開展基因組選擇等分子育種研究[6],與此同時(shí),國內(nèi)在羊分子育種方面也在不斷加大研究力度。 本研究梳理羊分子育種技術(shù)的研究進(jìn)展,同時(shí)提出關(guān)于羊育種的意見和建議,以期對羊育種事業(yè)提供一定的理論參考。

1 分子育種技術(shù)

1.1 分子標(biāo)記

分子標(biāo)記以其準(zhǔn)確性、多態(tài)性等優(yōu)點(diǎn),在羊育種研究與生產(chǎn)中已經(jīng)成功應(yīng)用了數(shù)十年,對于闡述羊不同品種間和不同個體間的性狀差異、解析相應(yīng)的分子遺傳基礎(chǔ)起著重要的作用[6-8]。 當(dāng)前應(yīng)用比較廣泛的分子標(biāo)記主要有微衛(wèi)星、單核苷酸多態(tài)性、插入缺失標(biāo)記和數(shù)量性狀基因座[4,6-7,9]。

微衛(wèi)星標(biāo)記(Microsatellite),又名簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeats,SSR),是指均勻分布于真核生物基因組中的簡單重復(fù)DNA 序列,由1—6 個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成,由于重復(fù)單位的重復(fù)數(shù)量在個體間呈高度變異性且變異數(shù)量豐富,因此微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用非常廣泛[10]。

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)主要指基因組水平上由單個核苷酸變異所引起的DNA 序列多態(tài)性變異,是畜禽可遺傳變異中最常見的一種。 隨著當(dāng)前高通量測序技術(shù)和芯片技術(shù)等生物技術(shù)的發(fā)展,SNP 的檢測已經(jīng)非常便捷,也成為應(yīng)用最廣泛的一種分子標(biāo)記。

插入缺失標(biāo)記(Insertion-deletion,InDel)指根據(jù)同一物種或近緣物種不同個體間基因組同一位點(diǎn)的序列發(fā)生不同大小DNA 片段而設(shè)計(jì)的引物,是全基因組中同源序列發(fā)現(xiàn)的差異。 InDel 長度1—10 000 bp,具有基因組分布廣泛、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn),是基因精細(xì)定位和圖位克隆中最為有效的標(biāo)記類型之一[11]。

數(shù)量性狀基因座(Quantitative trait locus,QTL)指影響數(shù)量性狀的一個染色體片段或特定染色體區(qū)域的微效多基因群,它為了解個體數(shù)量性狀基因之間的互作關(guān)系提供了路徑,QTL 定位是確定數(shù)量性狀基因在染色體上位置的有效方法。

1.2 分子育種

基于分子標(biāo)記的分子育種技術(shù)主要包括標(biāo)記輔助選擇(MAS)和全基因組選擇(GS)。 標(biāo)記輔助選擇是指通過對分子標(biāo)記的研究,根據(jù)分子標(biāo)記來輔助選擇其所控制的性狀,從而達(dá)到選擇某一優(yōu)勢特定性狀的目的,又稱分子標(biāo)記輔助選擇育種。 該方法為羊育種提供了有效的途徑,極大地縮了短育種間隔,提高了育種效率[12]。 全基因組選擇是利用覆蓋全基因組的高密度分子標(biāo)記進(jìn)行選擇育種的新方法,可通過早期選擇縮短世代間隔、提高育種值估計(jì)準(zhǔn)確性等來加快遺傳進(jìn)展,尤其對低遺傳力、難測定的復(fù)雜性狀具有較好的預(yù)測效果,從而真正實(shí)現(xiàn)基因組技術(shù)指導(dǎo)育種實(shí)踐[13]。

2 生長性狀研究

成纖維細(xì)胞生長因子受體1(FGFR1)因其在促肌細(xì)胞增殖中的作用,被認(rèn)為是肉羊生長性能的功能候選基因。 通過PCR-PFLP 法,在422 只母羊中共檢測到4 個SNP(g. 14752C > T、g. 45361A > G、g.49400A>G 和g.49587A>T)。 關(guān)聯(lián)分析表明,攜帶g.49587A>T 基因型AA 的個體體重和胸圍均顯著高于TT 基因型綿羊。 FGFR1 在3 個不同年齡段的肌肉組織中均有表達(dá),胎羔期的表達(dá)明顯高于成年母羊。 研究證實(shí)[14],FGFR1 的g.49400A>G 和g.49587A>T 參與了生長發(fā)育相關(guān)性狀調(diào)控,可作為提高藏綿羊生長性狀的分子標(biāo)記。

Pan 等[15]在探討不同綿羊品種PLAG1 基因的保守性時(shí),檢測了該基因的兩個InDel 變異體對中國魯西黑頭羊生長性狀的影響,結(jié)果顯示PLAG1 基因中的P2-del 30 bp 和P4-del 45 bp InDel 變異位點(diǎn)與綿羊體高等15 個生長性狀顯著相關(guān)。

Shi 等[1]在尋找與綿羊生長和肌肉發(fā)育相關(guān)基因的研究中,以雜交組合杜泊羊×小尾寒羊和雜交組合蒙古羊×小尾寒羊?yàn)檠芯繉ο?對背最長肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析和生物信息學(xué)分析,共鑒定出1 445 個差異表達(dá)基因(1 026 個上調(diào),419 個下調(diào)),其中有38 個是生長性狀相關(guān)基因、161 是與發(fā)育相關(guān)的基因,還有43 個是肌肉發(fā)育相關(guān)基因。

體型是反映綿羊生長和健康的重要指標(biāo)之一。 Jiang 等[16]對湖羊肉用核心群的親本(G1)和后代(G2)進(jìn)行基因分型,對兩組的體高、胸圍、體長、尾長、尾寬進(jìn)行GWAS(全基因組關(guān)聯(lián))分析,結(jié)果共檢測到5 個與體高相關(guān)的SNPs 和4 個與胸圍相關(guān)的SNPs。

MicroRNA(miRNA)在生長、發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。 通過mRNA 和miRNA 表達(dá)譜的深度測序比較表明,18 個miRNAs 和373 個基因在斷奶前和斷奶后的崇明白山羊中存在差異表達(dá)。 生物信息學(xué)分析表明,差異表達(dá)的基因參與了細(xì)胞過程、發(fā)育過程和生長過程。 KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析顯示,下調(diào)的基因在唾液分泌、膽汁分泌、血管平滑肌收縮和鈣信號通路中富集。 在下調(diào)的miRNAs 中,兩個(chi-miR-206 和chi-miR-133a∕b)與山羊肌肉發(fā)育相關(guān),另一個與細(xì)胞增殖相關(guān),RTqPCR 進(jìn)一步證實(shí)下調(diào)的miRNAs(chi-miR-99b-3p、chi-miR-224 和chi-miR-10b-5p)在快速生長期(7 月齡)崇明白山羊的肌肉組織(心臟、脾臟或腎臟)中高表達(dá)[17],推測這幾個miRNAs 與肌肉發(fā)育強(qiáng)相關(guān)。

3 繁殖性狀研究

Ren 等[18]研究表明,AHRA 基因的24 bp InDel 變異與澳洲白綿羊的產(chǎn)仔數(shù)和活產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān),該變異位點(diǎn)有助于綿羊產(chǎn)仔數(shù)和活產(chǎn)仔數(shù)的分子標(biāo)記輔助選擇育種,從而進(jìn)一步提高綿羊的繁殖性能。LLGL1A 基因的21-bp InDel 與陜北白絨山羊的產(chǎn)仔數(shù)極顯著相關(guān)[19],該變異位點(diǎn)可作為研究山羊產(chǎn)仔數(shù)的DNA 分子標(biāo)記。

PRNT 基因是朊病毒基因家族的一員,編碼一種在睪丸中特異表達(dá)的蛋白。 PRNT 基因最初被鑒定為睪丸特異性基因,在精子發(fā)生中發(fā)揮主要作用,而PRNT 基因mRNA 表達(dá)譜顯示,其在陜北白絨山羊的睪丸中低表達(dá),卻在卵巢中高表達(dá),對該基因序列進(jìn)一步的研究表明,共發(fā)現(xiàn)有3 個SNP 位點(diǎn),其中c.71A>G 位點(diǎn)的AA 基因型與產(chǎn)仔數(shù)極顯著相關(guān)(P=0.006)[20]。 這些發(fā)現(xiàn)可為標(biāo)記輔助選擇高繁殖性能山羊提供潛在的DNA 標(biāo)記。

對200 只3—5 歲的至少處于第三胎產(chǎn)羔期的薩爾達(dá)綿羊進(jìn)行連續(xù)2 年監(jiān)測,結(jié)果顯示,MTNR1A 基因內(nèi)檢測到29 個SNP 位點(diǎn),其中有5 個SNP 位點(diǎn)引起氨基酸的改變,位點(diǎn)g.17355452C>T(SNP16,rs430181568)和g.17355358C>T(SNP17,rs407388227)是連鎖的且與懷孕周期顯著相關(guān),C∕C 基因型母羊的交配高峰比T∕T 基因型母羊早30 d[3]。 這一結(jié)果說明MTNR1A 基因新多態(tài)性與母羊繁殖性能恢復(fù)有關(guān)。

4 肉質(zhì)性狀研究

背最長肌的肌內(nèi)脂肪含量和脂肪酸組成隨著山羊的生長而發(fā)生變化,其也參與決定山羊肉的風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值。 在一項(xiàng)山羊肉質(zhì)研究中,對采集自羔羊、青年羊和成年山羊的背最長肌組織DNA 進(jìn)行測序,結(jié)果表明,在24 689 個Unigenes(Universal genes)中,有20 435 個Unigenes 被注釋,在不同出生階段鑒定出111 個注釋差異表達(dá)基因,并通過序列聚類分析將其劃分為16 種可能的表達(dá)模式。 采用GO(Gene ontology)功能分類分析,篩選出與脂質(zhì)代謝相關(guān)的最高表達(dá)基因,并通過共表達(dá)分析確定了脂質(zhì)代謝調(diào)控的節(jié)點(diǎn)基因,揭示了在山羊不同生長階段肌肉發(fā)育和脂質(zhì)代謝中具有功能調(diào)控作用的候選基因[21]。

劉學(xué)峰等[2]指出,CAPN1 和CAPN2 基因上的兩個多態(tài)性位點(diǎn)C724A 和A601G 與德國美利奴羊肌內(nèi)脂肪含量明顯相關(guān),說明這兩個多態(tài)性位點(diǎn)可以作為培育優(yōu)質(zhì)肉用或肉毛兼用德國美利奴羊品種時(shí)的參考分子標(biāo)記。 Yuan 等[22]研究指出,鑒定出的eQTL 具有顯著性,與56 個胴體性狀和脂肪酸譜相關(guān)。 例如,肌肉中的幾個geQTL 定位于FAM184B 基因,肝臟和肌肉中的數(shù)百個sQTL 定位于CAST 基因,肝臟中的數(shù)百個sQTL 定位于C6 基因,而這3 個基因都與綿羊肌肉組成或者脂肪酸含量有關(guān)。

綿羊肉脂肪酸含量的遺傳力為0.25—0.46,表明所評價(jià)性狀存在較大的遺傳變異,故而有可能通過選擇改變脂肪酸譜。 Rovadoscki 等[23]在綿羊染色體1、2、3、5、8、12、14、15、16、17 和18 上發(fā)現(xiàn)了包含與脂肪酸組成相關(guān)的10 個相鄰SNPs 的27 個基因組區(qū)域,每個區(qū)域可解釋0.30%的加性遺傳變異。 此外,這些區(qū)域還發(fā)現(xiàn)了23 個綿羊脂肪組成遺傳機(jī)制相關(guān)聯(lián)的基因,如DGAT2、TRHDE、TPH2、ME1、C6、C7、UBE3D、PARP14 和MRPS30。

5 遺傳多樣性研究

分子標(biāo)記在群體遺傳多樣性研究和評價(jià)中也應(yīng)用廣泛。 在對四川省涼山地區(qū)6 個綿羊群體的遺傳多樣性研究中,王婷等[24]利用12 個微衛(wèi)星標(biāo)記計(jì)算綿羊群體的基因頻率、有效等位基因數(shù)、雜合度及多態(tài)信息含量,以此來評估群體內(nèi)遺傳多樣度,進(jìn)而通過遺傳距離聚類圖、群體結(jié)構(gòu)推測圖、主成分分析及群體間分子方差分析等評估群體間遺傳關(guān)系。 為了從分子層面解析我國青海、西藏、云南、甘肅和四川等5 個地區(qū)綿羊群體的遺傳關(guān)系,胡亮等[25]使用綿羊600 K 芯片對這5 個地區(qū)的20 個藏系綿羊群體進(jìn)行掃描分型,基于雜合度和近交系數(shù)分析藏系綿羊群體的遺傳多樣性,結(jié)果顯示云南和西藏地區(qū)藏系綿羊能夠單獨(dú)聚成一支,且這兩地區(qū)羊群的遺傳多樣性普遍低于青海、甘肅和四川地區(qū)的藏系綿羊;而青海、甘肅和四川地區(qū)的草地型綿羊混亂聚集在一起;此外,云南和西藏地區(qū)的藏系綿羊基本能保持地域特異性,而青海、甘肅和四川地區(qū)綿羊在遺傳距離和群體結(jié)構(gòu)上差異不大。

崇明白山羊是在上海市崇明區(qū)獨(dú)特的地理環(huán)境和水土條件下經(jīng)人工選擇孕育而成的優(yōu)良地方品種。Gao 等[26]對10 個家山羊品種進(jìn)行了全基因組重測序,探討了崇明白山羊的基因組特征和選擇信號特征。該研究共鑒定出23 508 551個SNPs 和2 830 800 個InDels,進(jìn)一步鑒定出崇明白山羊品種特異性的SNPs共271 713 個,InDels 共24 843 個。 此外,基于全基因組FST和聚合雜合度(Hp)計(jì)算,進(jìn)一步鑒定了該山羊品種與其他9 個山羊品種之間的選擇特征基因,這些基因與神經(jīng)系統(tǒng)(C2CD3、DNAJB13、UCP2、ZMYND11、CEP126、SCAPER、TSHR 基因)、生長(UCP2、UCP3、TSHR、FGFR1、ERLIN2、ZNF703 基因)和毛色(KITLG、ASIP、AHCY、RALY 和MC1R 基因)顯著相關(guān)。 結(jié)果表明,由于自然選擇和人工選擇,崇明山羊品種在神經(jīng)系統(tǒng)方面可能與其他山羊品種有所不同。

6 全基因組選擇育種

全基因組選擇育種也是一種標(biāo)記輔助選擇育種方式。 該技術(shù)使用覆蓋整個基因組的遺傳標(biāo)記,使所有數(shù)量性狀位點(diǎn)至少與一個分子標(biāo)記處于連鎖不平衡狀態(tài),可通過早期選擇而縮短世代間隔。 Gore等[27]指出,與傳統(tǒng)方法相比,全基因組選擇育種通常具有更高的年度遺傳進(jìn)展和更高的性價(jià)比。 遺傳進(jìn)展與交配方式也有關(guān),與自然交配和傳統(tǒng)選擇法相比,利用繁殖技術(shù)和基因組選擇的交配策略可以提高羊只對選擇的反應(yīng)。 該研究還發(fā)現(xiàn),人工鮮精的授精策略所取得的遺傳進(jìn)展等優(yōu)于自然交配策略和人工凍精輸精策略。

動物繁殖技術(shù)如超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)(MOET)以及后備母羊體外受精和胚胎移植技術(shù)(JIVET),已經(jīng)被證明可通過增加選擇強(qiáng)度和縮短世代間隔加速遺傳進(jìn)展。 Granleese 等[28]以澳大利亞綿羊?yàn)檠芯繉ο?基于增加優(yōu)良性狀、近交繁殖程度而優(yōu)化的全基因組信息和配對選擇策略,進(jìn)而確定在育種計(jì)劃中對個體配種的最佳生殖技術(shù)組合。 相對于傳統(tǒng)的本交育種,利用MOET 技術(shù)和JIVET 技術(shù)的育種策略可增強(qiáng)母羊選擇強(qiáng)度和縮短世代間隔,從而獲得更高的年度遺傳進(jìn)展。 全基因組選擇提高了幼齡候選羊只的選擇準(zhǔn)確性,從而進(jìn)一步加速了遺傳進(jìn)展,使得全基因組選擇策略比傳統(tǒng)選擇策略更精確[28-30]。

7 總結(jié)與展望

山羊和綿羊在改善人類生計(jì)中發(fā)揮著重要的作用,是肉、奶、纖維和獸皮的主要來源之一[31],特別是在干旱地區(qū)和貧困山區(qū),山羊和綿羊的飼養(yǎng)可促進(jìn)人民生活水平的提高。 我國擁有眾多的地方山羊和綿羊品種資源,研究和保護(hù)群體遺傳多樣性是確保種業(yè)安全與發(fā)展的根本[32],品種資源是羊育種的寶貴素材,結(jié)合分子育種技術(shù)與常規(guī)育種手段,可以加速培育羊新品種(品系)。

在養(yǎng)殖生產(chǎn)中,羊的體尺性狀已被廣泛認(rèn)為是生長和健康的重要指標(biāo),影響到喂養(yǎng)和管理以及對環(huán)境的適應(yīng)[16,33-34]。 肌內(nèi)脂肪含量影響著羊肉的風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值,瘦肉中的脂肪斑點(diǎn)和條紋被稱為大理石紋,與多汁和風(fēng)味等正相關(guān)。 最優(yōu)肌內(nèi)脂肪含量和脂肪酸組成對人體健康也有好處。 兼顧羊的生長發(fā)育與優(yōu)良肉質(zhì)性狀的遺傳改良是當(dāng)前羊育種的主要目標(biāo)之一。

高通量測序和全基因組關(guān)聯(lián)分析為羊品種的遺傳多樣性和經(jīng)濟(jì)性狀探索提供了新的思路和技術(shù)手段,便于挖掘優(yōu)良基因、開發(fā)新的育種分子標(biāo)記,通過標(biāo)記輔助選擇或全基因組選擇育種,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)羊品種遺傳改良。 基于分子標(biāo)記的分子育種技術(shù)為提高羊育種效率做出了重要的貢獻(xiàn)。 近年來興起的分子設(shè)計(jì)育種也是分子育種的進(jìn)一步演繹,主要是利用分子生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)關(guān)于基因功能和生物大分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)知識來設(shè)計(jì)和改良畜禽品種,從而大大縮短育種時(shí)間[35]。 越來越多的成功應(yīng)用預(yù)示著分子育種是未來羊育種的一個重要發(fā)展方向。