祖立闖，李 嬌，謝金文，李 峰，王文秀，4

（1.淄博市動物疫病預(yù)防與控制中心，山東 淄博 255000；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；3.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；4.山東省院士工作站，山東 濱州 256600）

2015年6月，美國某豬場發(fā)生了一起母豬皮炎腎病綜合征和繁殖障礙為主要特征的疫病，Palinski等[1]研究表明該病例的致病原為一種新型豬圓環(huán)病毒，命名為豬圓環(huán)病毒3型（Porcine circovirus type 3, PCV3），隨后我國研究學者在國內(nèi)養(yǎng)豬密集地區(qū)陸續(xù)檢測并分離到PCV3，且進一步研究表明PCV3具有類似PCV2（Porcine circovirus type 2, PCV2）的臨床癥狀和致病性，推斷PCV3將類似PCV2成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的又一個免疫抑制性疫病[2-5]。故當前加強PCV3的診斷和流行病學監(jiān)測，對PCV3的綜合防控和保障我國養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展均具有十分重要的現(xiàn)實意義。鑒于此，筆者就目前我國PCV3各種實驗室診斷技術(shù)的最新研究進展和PCV3的感染現(xiàn)狀進行概述，為提高我國PCV3實驗室診斷水平以及改善PCV3綜合防控措施提供參考。

1 PCV3的檢測方法

1.1 PCR方法

PCR方法是當前體外擴增DNA最簡單、快速的分子生物學檢測技術(shù)，在基層獸醫(yī)實驗室得到了廣泛應(yīng)用。楊威等[6]和姜玲玲等[7]分別根據(jù)PCV3特異性序列設(shè)計引物，經(jīng)PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，均建立了PCV3 PCR檢測方法，能夠分別特異性擴增出418 bp和649 bp目的基因片段，能夠擴增的最低模板量分別為1.13×10-3ng/μL和0.143 ng/μL。楊威等[6]和姜玲玲等[7]建立的PCR檢測方法操作簡單、檢測快速，可用于PCV3的快速檢測和流行病學調(diào)查。

1.2 套式PCR方法

套式PCR方法由常規(guī)PCR方法引申而來，其經(jīng)過二輪PCR擴增反應(yīng)，第2輪PCR擴增反應(yīng)以第1輪PCR擴增產(chǎn)物為模板，大幅增加了檢測的敏感性。張靜等[8]根據(jù)PCV3全基因組保守區(qū)域設(shè)計2對特異性引物，建立PCV3套式PCR檢測方法，該方法僅對PCV3檢測呈陽性，最低檢測限為1.74×10拷貝/μL，與商品化檢測試劑盒的符合率較高，可用于PCV3核酸的低含量檢測。楊永寧等[9]根據(jù)PCV3基因序列設(shè)計合成了內(nèi)、外兩對引物，建立PCV3套式PCR檢測方法，該方法檢測PCV2、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）均為陰性，外引物PCR擴增的檢測靈敏度為17 ng DNA，內(nèi)引物PCR擴增的檢測靈敏度為0.17 ng DNA，可用于臨床病料中PCV3的快速檢測。套式PCR方法所用試驗試劑和操作方法均與常規(guī)PCR方法相同，但其由于增加了一輪PCR擴增反應(yīng)，導(dǎo)致其檢測所需時間有所延長。

1.3 熒光PCR方法

熒光PCR方法是將光譜技術(shù)引入到PCR擴增反應(yīng)，其融匯了常規(guī)PCR方法快速、特異性擴增的優(yōu)點和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點，克服了常規(guī)PCR方法不能定量、需要核酸電泳檢測等缺點，但熒光PCR方法試驗操作技術(shù)要求較高、試劑成本較高。楊斌等[10]根據(jù)PCV3 Cap基因保守區(qū)域設(shè)計了特異性引物和探針，建立了PCV3 TaqMan熒光定量PCR檢測方法，該方法的檢測靈敏度可達到11.8拷貝/μL，組內(nèi)和組間重復(fù)試驗的變異系數(shù)均小于2%，檢測PCV2、CSFV、PRRSV、PRV均為陰性。駱輝等[11]根據(jù)GenBank中PCV3全基因組序列高度保守區(qū)域設(shè)計了1對特異性引物和探針，通過對反應(yīng)體系和擴增條件進行優(yōu)化，建立了能夠特異性檢測PCV3的熒光定量PCR方法，該方法的最低檢出濃度為7.87×10-1拷貝/μL，檢測PCV2、PRV、PPV、PRRSV、豬乙型腦炎病毒（JEV）、TGEV、PEDV均為陰性，組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均小于1%。暢通等[12]根據(jù)PCV3 ORF2基因的保守序列設(shè)計1對特異性引物和TaqMan探針，通過構(gòu)建標準品質(zhì)粒來制作熒光定量PCR標準曲線，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了檢測PCV3的實時熒光定量PCR方法，該方法可以特異性檢測出PCV3，而檢測PCV2、CSFV、PRRSV、PEDV、PPV、PRV均為陰性，該方法的檢測靈敏度可以達到10拷貝/μL，批內(nèi)和批間重復(fù)試驗的變異系數(shù)均小于2%。熒光PCR方法具有快速、靈敏性高、特異性強、定量準確等優(yōu)點，可為我國PCV3的早期檢測及流行病學調(diào)查提供可靠的技術(shù)支持。

1.4 等溫擴增方法

等溫擴增法為一種新型的核酸擴增方法，該方法無需PCR儀等特殊儀器，只需要在常規(guī)水浴鍋中即可完成整個擴增反應(yīng)，具有操作簡單、靈敏度高、肉眼判讀等優(yōu)點，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用，目前在PCV3的檢測中常用的等溫擴增法主要有環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）方法和重組酶介導(dǎo)等溫擴增（RAA）方法。

1.4.1 LAMP方法 朱小甫等[13]根據(jù)PCV3全基因序列設(shè)計了4條特異性引物，通過反應(yīng)成分和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測PCV3的LAMP方法，該方法的檢測極限為10個拷貝/μL質(zhì)粒模板，檢測PCV2、PRV、PPV、豬大腸桿菌、豬沙門氏菌DNA均為陰性，與常規(guī)PCR方法的符合率為97.6%。姜辰龍等[14]根據(jù)PCV3 ORF2基因保守序列設(shè)計特異性引物，建立了檢測PCV3的LAMP方法，該方法59 ℃恒溫擴增36 min即可出現(xiàn)梯形條帶，最低檢測限為1.0×10-1拷貝/μL，檢測圓環(huán)病毒1型（PCV1）、PCV2、PRRSV、PRV、CSFV均為陰性，該方法與PCR方法的符合率為95.6%。相對傳統(tǒng)PCR方法而言，LAMP方法敏感特異、簡便快速，可用于PCV3快速檢測和臨床診斷。

1.4.2 RAA方法 吳江等[15]根據(jù)PCV3 Cap基因的保守序列設(shè)計多對引物和探針，通過篩選引物和優(yōu)化試驗條件，建立了一種檢測PCV3的RAA方法，該方法可在39 ℃恒溫條件下20 min內(nèi)快速完成特異擴增反應(yīng)，檢測PCV2、CSFV、PRRSV、豬A型塞內(nèi)卡病毒（SVA）、口蹄疫病毒（FMDV）均為陰性，最低檢出濃度為10-2拷貝/μL，與常規(guī)PCR方法的符合率為100%。RAA方法操作簡單、快速靈敏、結(jié)果可靠，可用于PCV3的實驗室檢測和現(xiàn)場診斷。

1.5 ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）方法

ELISA方法具有簡單、快捷、敏感、特異、高通量等優(yōu)點，特別適合大批量樣品的檢測和大面積的流行病學調(diào)查，是當前基層獸醫(yī)實驗室使用最廣泛的免疫學檢測技術(shù)。目前在PCV3的檢測中常用的ELISA方法主要檢測PCV3抗體的間接ELISA方法和檢測PCV3抗原的雙抗夾心ELISA方法。

1.5.1 間接ELISA方法 葛玉鳳等[16]選擇PCV3 ORF2基因中免疫原性較強的一段序列進行截短表達，以獲得的重組Cap蛋白為包被抗原，通過間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立PCV3重組Cap蛋白間接ELISA抗體檢測方法，該方法檢測PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PPV、PEDV、TGEV陽性血清均為陰性，對PCV3抗體的最低檢出效價可達1∶25 600，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別小于5%和10%。何博等[17]采用PCR方法對PCV3 ORF2基因主要抗原區(qū)域進行擴增，并利用原核表達系統(tǒng)進行截短表達，以純化后的重組蛋白作為包被抗原建立了間接ELISA抗體檢測方法，對PCV3陽性血清的最低檢出效價可達1∶20 480，檢測PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、PRV、JEV、PEDV、TGEV等豬常見疫病陽性血清均為陰性，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均小于5%。謝曉妍等[18]以PCV3衣殼蛋白為包被抗原，通過篩選和優(yōu)化反應(yīng)條件，建立一種檢測PCV3抗體的間接ELISA方法，該方法批內(nèi)和批間變異系數(shù)都小于5%。間接ELISA方法操作簡單、檢測快速、通量高，為臨床中PCV3感染的診斷和流行病學調(diào)查等提供一種敏感、特異、簡便、快速、高通量的血清學檢測技術(shù)。

1.5.2 夾心ELISA方法 于俊楠等[19]利用抗PCV3 Cap蛋白的單克隆抗體，通過篩選最佳包被濃度、最佳包被時間、一抗和二抗最佳濃度，建立了檢測PCV3的夾心ELISA方法，該方法單克隆抗體的最佳包被濃度為10 μg/mL（1∶200），一抗最佳稀釋倍數(shù)為1∶4 000稀釋，二抗最佳稀釋倍數(shù)為1∶5 000，能夠特異性檢測PCV3，與PCV2等多種病毒不存在交叉反應(yīng)，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均小于5%。夾心ELISA方法可用于臨床中PCV3的鑒別檢測，特別適合于PCV3的大面積流行病學調(diào)查。

1.6 膠體金免疫層析方法

膠體金免疫層析方法是將膠體金標記技術(shù)、層析分離技術(shù)引入到免疫學反應(yīng)，具有不需特殊儀器、簡便、快速、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點，在動物疫病快速檢測中顯示出了良好的應(yīng)用前景。高茵[20]利用原核表達系統(tǒng)獲得大小為42 kDa的PCV3-Cap蛋白，經(jīng)過Western Blot驗證PCV3-Cap蛋白能與鼠源抗PCV3單克隆抗體進行特異性的結(jié)合。將重組PCV3-Cap蛋白固定于檢測線，將雞抗葡萄球菌A蛋白（SPA）抗體固定于質(zhì)控線，通過對膠體金的最佳標記pH、最佳SPA標記量、膠體金復(fù)溶液最佳劃膜濃度進行篩選，組裝檢測PCV3的膠體金試紙條，該試紙條的膠體金最佳標記pH為8.0，最佳SPA標記濃度為2.5 μg/mL，最佳質(zhì)控線劃線濃度為0.4 mg/mL，該試紙條具有良好的穩(wěn)定性和特異性，密封干燥保存2個月仍具有良好的靈敏性，臨床隨機檢測結(jié)果顯示膠體金免疫層析試紙條與ELISA檢測結(jié)果完全一致。膠體金免疫層析方法具有簡便、快速、穩(wěn)定等優(yōu)點，特別適合于廣大基層獸醫(yī)人員使用，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。

2 PCV3的感染現(xiàn)狀

隨著我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，豬群異地流動加劇，動物疫病的發(fā)生與流行率隨之增加，研究學者高度重視動物疫病的流行病學監(jiān)測，掌握不同地區(qū)PCV3的感染情況，可及時準確的因地制定綜合防控措施。何慶等[21]采用PCR方法對2015—2017年湖南省680份豬流產(chǎn)胎兒病料樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為24.4%。趙晶等[22]采用PCR方法對2018—2020年廣西1 308份豬組織病料樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為5.58%。劉燕等[23]采用PCR方法對2017—2019年鄭州地區(qū)1 175份豬組織病料樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為14.6%。何世成等[24]采用熒光PCR方法對湖南省14個市州821份臨床病料樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為33.98%。高詩敏等[25]采用PCR方法對2019年山西省11地市521份豬肺臟組織樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為85.22%。肖興等[26]采用PCR方法對湖南省和京津冀地區(qū)523頭斷奶仔豬血清樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為68.75%。雷明霞等[27]采用PCR方法對內(nèi)江市14個病死畜禽無害化場108份病料樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為12.9%。師乾凱等[28]采用PCR方法對2017—2018年河北省60個豬場310份臨床病料樣本進行PCV3檢測，PCV3陽性率為16.5%。魏其等[29]采用巢式PCR方法對北疆地區(qū)40份豬血液樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為50.0%。李蕊等[30]采用PCR方法對北京市8個區(qū)縣56個養(yǎng)殖場1 177份臨床樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為1.0%。曾彩虹等[31]采用PCR方法對云南省12個地市29縣區(qū)431份臨床樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為9.98%。郭影成等[32]采用PCR方法對2015—2017年吉林省484份豬血清樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為28.1%。劉東旭等[33]采用PCR方法對吉林部分地區(qū)10家規(guī)模化豬場704份樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為34.2%，PCV3和PCV2混合感染率為22.7%。王會杰等[34]采用PCR方法對河北省2014—2018年209份病料樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為34.2%，PCV3和PCV2混合感染率為19.61%。鐘順平等[35]采用PCR方法對云南省勐臘縣86份樣本進行PCV3檢測，PCV3陽性率為17.44%，PCV3和PCV2混合感染率為15.12%。何長生等[36]采用熒光PCR方法對2018年安徽省3個地區(qū)12個豬場239份扁桃體樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為14.6%，PCV3和PCV2混合感染陽性率為5.0%。段群棚等[37]采用PCR方法對2017—2019年廣西482個規(guī)模豬場917份病豬樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為15.81%，PCV3和PCV2混合感染率為11.72%。李靜等[38]采用PCR方法對新疆6個地區(qū)449份豬全血或組織樣品進行PCV3檢測，PCV3陽性率為14.5%，PCV3和PCV2混合感染率為15.4%，PCV3和PRRSV混合感染率為16.9%，PCV3、PCV2和PRRSV三重混合感染率為15.4%，PCV3、PCV2、PRV、PRRSV四重混合感染率為1.5%。以上流行病學調(diào)查表明，PCV3在我國不同地區(qū)均有一定的流行率，但不同地區(qū)陽性感染率差異較大，且PCV3和PCV2、PRRSV等致病原的混合感染情況較嚴重，應(yīng)加強混合感染的防控。

3 結(jié)語

近年來，PCV3的流行增加了PCV2綜合防控的難度，鑒于過去PCV2給我國養(yǎng)豬業(yè)造成的巨大危害，當前提高PCV3的實驗室檢測能力，掌握不同地區(qū)PCV3的感染情況對PCV3的綜合防控至關(guān)重要。在PCV3的各種檢測方法中，PCR方法最簡單、最便捷，但其敏感性低于套式PCR方法和熒光PCR方法，且PCR方法需要核酸電泳，造成了溴化乙錠（EB）對環(huán)境的污染；套式PCR方法的敏感性提高，但需要二輪PCR擴增反應(yīng)，檢測時間增加；熒光PCR方法敏感性大幅提高，且不需要核酸電泳，但其檢測所需儀器設(shè)備、檢測成本提高；LAMP和RRA等溫擴增方法雖然不需要昂貴儀器設(shè)備，但引物設(shè)計較難，且檢測過程中容易產(chǎn)生污染，出現(xiàn)假陽性；ELISA和膠體金免疫層析等免疫學方法檢測快速、高通量，但具有一定的滯后性，無法對疫病早期或潛伏感染期進行診斷。在PCV3的感染現(xiàn)狀方面，我國不同地區(qū)均存在PCV3的流行，但不同地區(qū)陽性感染率差異較大，且存在PCV3和PCV2、PRRSV等致病原的混合感染?？傊?，PCV3作為近年來新發(fā)的一種病毒病，其各種檢測方法均具有自身的優(yōu)勢和缺點，不同實驗室可根據(jù)自身條件選擇自己適合的檢測方法，同時PCV3在我國已經(jīng)具有一定的流行率，應(yīng)逐步加強PCV3的綜合防控措施。