應(yīng)激致功能性下丘腦性閉經(jīng)動(dòng)物模型研究進(jìn)展

萬坤銘，孫 帥，俞超芹

(上海長海醫(yī)院中醫(yī)婦科，上海 200433)

功能性下丘腦性閉經(jīng)(functional hypothalamic amenorrhea,FHA)是除外下丘腦、垂體等器質(zhì)性病變，由于循環(huán)中促性腺激素和雌激素水平均低而導(dǎo)致的一種好發(fā)于年輕女性的中樞性閉經(jīng)。FHA是現(xiàn)代女性常見的閉經(jīng)原因之一，據(jù)估計(jì)，在所有繼發(fā)性閉經(jīng)中FHA占15%～48%[1]。FHA對(duì)女性健康包括生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼和心理狀態(tài)等造成威脅。FHA的基本特點(diǎn)是下丘腦-垂體-卵巢(hypothalamic-pituitary-ovarian,HPO)軸的抑制。正常的生理情況下，下丘腦通過脈沖式分泌促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)促進(jìn)垂體前葉分泌卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)和黃體生成素(luteinzing hormone，LH)，F(xiàn)SH的主要功能是刺激卵巢生長及卵泡發(fā)育；LH的功能是促進(jìn)卵泡最后成熟，觸發(fā)排卵，促進(jìn)黃體形成維持其功能；兩者相互配合促進(jìn)卵巢合成分泌3種性激素，即雌激素、孕激素、雄激素，而雌激素、孕激素對(duì)下丘腦和垂體又有反饋調(diào)節(jié)作用[2]。FHA由于GnRH脈沖式分泌不足，導(dǎo)致FSH、LH水平降低致使雌激素水平低下，正常的生殖內(nèi)分泌穩(wěn)態(tài)被打破[3]。越來越多研究[4-6]表明，F(xiàn)HA的發(fā)生發(fā)展與能量代謝和精神壓力密切相關(guān)，其具體誘因一般包括體重減少或營養(yǎng)不足、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練、各種因素導(dǎo)致的心理壓力過大等[7-9]。為更好地建立穩(wěn)定有效的FHA動(dòng)物模型，筆者從FHA病理生理及臨床特點(diǎn)出發(fā)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，探討可能有效的FHA的動(dòng)物造模方式，為今后的相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供助益。

1 心理應(yīng)激

1.1 造模方式及應(yīng)用

1.1.1 束縛應(yīng)激

束縛應(yīng)激是目前常用的一種模擬心理應(yīng)激的模型之一，它能較好地模擬人類社會(huì)生活中擁擠、壓力大、挫折等生活狀態(tài)。束縛應(yīng)激通過固定實(shí)驗(yàn)對(duì)象的四肢或?qū)?shí)驗(yàn)對(duì)象放置于特制的容器內(nèi)剝奪其一定程度的活動(dòng)自由。YANG等[10]研究了急性束縛應(yīng)激對(duì)雌性小鼠的LH脈沖、RFamide-related peptide 3(Rfrp3)、Kisspeptin的表達(dá)和相應(yīng)神經(jīng)元激活的影響。該實(shí)驗(yàn)首先將小鼠雙側(cè)卵巢切除，之后進(jìn)行180 min的連續(xù)LH監(jiān)測(cè)(每5 min取3 μL尾尖血進(jìn)行檢測(cè))，前90 min所有小鼠處于自由活動(dòng)狀態(tài)，后90 min對(duì)照組小鼠仍然自由活動(dòng)，但應(yīng)激組小鼠均被置于特制狹小容器內(nèi)。結(jié)果顯示束縛應(yīng)激能明顯地抑制LH的脈沖式分泌。式樣進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)束縛180 min后，相對(duì)于對(duì)照組，應(yīng)激組Rfrp細(xì)胞數(shù)量顯著增加20%，Kiss1和cfos的共表達(dá)顯著減少(P<0.05)。KINSEY JONES等[11]發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果，他們的實(shí)驗(yàn)中大鼠在束縛60 min后即出現(xiàn)LH的分泌抑制，以及下丘腦Kiss-1的表達(dá)量下降(P<0.05)。

除了急性束縛，在慢性束縛應(yīng)激方面也有學(xué)者做了研究。韓潔等[12]建立重復(fù)制動(dòng)大鼠模型，研究慢性束縛對(duì)雌性大鼠HPO軸的影響。他們將40只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和束縛組各20只，對(duì)照組正常飼養(yǎng)，束縛組采取遞增負(fù)荷束縛應(yīng)激，每天置于束縛器內(nèi)束縛應(yīng)激1次，第1日束縛2 h，以后采用遞增負(fù)荷，每日增加0.5 h，持續(xù)2周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)束縛組大鼠動(dòng)情周期明顯延長，LH、雌二醇(E2)含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，下丘腦GnRH，垂體促性腺激素釋放激素受體(gonadotropin releasing hormone receptor,GnRHR)、FSH、LH的mRNA表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。FOTSING等[13]同樣也發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應(yīng)激(每天束縛3 h，共造模28 d)造模下的雌性大鼠動(dòng)情期時(shí)間減少，血清FSH、LH、E2水平都顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。這些實(shí)驗(yàn)都提示慢性束縛應(yīng)激能干擾HPOA的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能。

1.1.2 慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激

慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激(chronic unpredictable stress，CUS)是一種多因素復(fù)合型應(yīng)激方式，主要包括束縛、游泳、懸尾、晝夜顛倒、噪音、擁擠飼養(yǎng)、冷水刺激等，是目前最為常見的抑郁癥造模方式之一。一般來說，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天會(huì)被隨機(jī)賦予一到兩種應(yīng)激源的刺激，相鄰2 d的應(yīng)激方式避免重復(fù)，或者同種應(yīng)激方式強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，以避免動(dòng)物出現(xiàn)適應(yīng)現(xiàn)象，造模持續(xù)時(shí)長一般在2周以上。有研究[14]表明，慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激4周可導(dǎo)致雌性大鼠下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸興奮與HPO軸的抑制，導(dǎo)致血清皮質(zhì)酮(corticosterone,CORT)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)水平顯著提高，F(xiàn)SH、LH、E2顯著降低(P<0.05)。

1.1.3 其他造模方式

王建紅等[15]采用聲-光-電復(fù)合刺激雌性大鼠，先是噪音加強(qiáng)光刺激大鼠10 s，之后立即加上點(diǎn)擊足底60 s，如此造模20 d，發(fā)現(xiàn)大鼠動(dòng)情周期紊亂，血清E2、P水平顯著低于對(duì)照組，垂體、卵巢重量偏低(P<0.05)。而WAGENMAKER等[16]以母羊?yàn)檠芯繉?duì)象，依照隔離飼養(yǎng)80 min、蒙住雙眼80 min、犬吠刺激80 min順序接受刺激，發(fā)現(xiàn)母羊的下丘腦GnRH、垂體LH的脈沖式分泌幅度被大幅抑制。

1.2 模型評(píng)價(jià)

依據(jù)文獻(xiàn)來看，各種心理應(yīng)激造模方式相比，束縛造模方式更為穩(wěn)定。FHA是長期因素導(dǎo)致的疾病，故而各種急性應(yīng)激的造模方式，雖能導(dǎo)致LH或GnRH的脈沖式分泌被抑制，但終究不合適作為FHA的造模方式。長期束縛應(yīng)激造模的缺陷在于，造模方式的單一容易引起動(dòng)物適應(yīng)，雖然可以通過增加束縛時(shí)長解決這一問題，但過長的造模時(shí)長也有問題，韓潔[17]的另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)每天束縛6 h，3個(gè)月后會(huì)出現(xiàn)卵巢損傷，導(dǎo)致FSH水平上升。

CUS造模方式差異性大，從KATZ等[18]于1981年創(chuàng)立至今，具體采用哪些應(yīng)激源，采用怎樣的應(yīng)激強(qiáng)度，仍然千差萬別，不同的應(yīng)激源和應(yīng)激強(qiáng)度會(huì)導(dǎo)致不同的造模效果。比如，同樣是CUS法造模，F(xiàn)U等[19]顯示大鼠卵巢早衰發(fā)生，F(xiàn)SH水平顯著提高；GAO等[20]的結(jié)果之一也是FSH水平的顯著上升。這與FHA的激素變化特征不一致。

總之，對(duì)于FHA的造模，在心理應(yīng)激方面，慢性束縛應(yīng)激可能是較為穩(wěn)定的一種造模方法。

2 能量限制

2.1 造模方式及應(yīng)用

控制能量維持在低水平，其最直觀最常用的方法就是控制食物攝入量，只為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供少于其正常需求量的食物。以老鼠為例，通常將其單籠飼養(yǎng)，通過前期測(cè)定或根據(jù)對(duì)照組的進(jìn)食量預(yù)估其每日食物正常需求量，之后每日提供其少于此量的食物，以達(dá)到食物限制的目的。栗麗[21]依據(jù)此法研究能量限制對(duì)成年雌性大鼠生殖潛能的影響，他們將成年雌性SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、25%能量限制組(每只大鼠每日攝食量為對(duì)照組的75%)、45%能量限制組(每只大鼠每日攝食量為對(duì)照組的55%)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，25%能量限制組大鼠有25%動(dòng)情周期不規(guī)則，45%能量限制組有60%動(dòng)情周期不規(guī)則；通過對(duì)血清激素的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)第4周時(shí)，兩能量限制組大鼠血清LH、FSH與對(duì)照組相比均有明顯下降(P<0.05)。陳曉純等[22]同樣發(fā)現(xiàn)25%能量限制8周時(shí)有近55%(6/11)SD雌性大鼠出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂。AHMED等[23]發(fā)現(xiàn)50%食物限制的SD大鼠，1個(gè)月后LH、FSH、E2水平均顯著降低(P<0.05)，并且發(fā)現(xiàn)這可能與其下丘腦kisspeptin、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,cdc2)、細(xì)胞周期蛋白B的表達(dá)量下降有關(guān)。

也有研究者選取其他哺乳動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。LI等[24]將青春期前母羊分為對(duì)照組、低限食組(每天每只羊食物攝入量為對(duì)照組70%)、高限食組(每天每只羊食物攝入量為對(duì)照組50%)，限食53 d后，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，兩限食組的下丘腦RFRP-3表達(dá)量顯著增加，下丘腦和垂體的GnRHR表達(dá)量顯著下降，垂體中的FSHR以及下丘腦中的LHR表達(dá)量也顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。ZHOU等[25]觀察了營養(yǎng)限制對(duì)母豬生殖內(nèi)分泌相關(guān)激素水平的影響，發(fā)現(xiàn)與正常飼養(yǎng)母豬(每只每天進(jìn)食量為2.86 kg)相比，營養(yǎng)限制的母豬(每只每天進(jìn)食量為1 kg)循環(huán)血中IGF-1、E2、FSH、LH、孕酮、瘦素水平顯著下降(P<0.05)；同時(shí)明顯下調(diào)了下丘腦kisspeptin、GnRH、ERα的基因表達(dá)(P<0.05)。

這些研究都提示，食物限制對(duì)于雌性哺乳動(dòng)物HPOA有著明確的抑制作用，并且與下丘腦的變化緊密相連。

2.2 模型評(píng)價(jià)

一定程度的食物限制能明確地下調(diào)血清LH、FSH、E2水平，但如果這一過程過長，則造模效果可能會(huì)下降。上述栗麗[21]的研究進(jìn)行到第10周時(shí)，與對(duì)照組相比，F(xiàn)SH水平已無明顯差異(P>0.05)，LH水平反而較第4周時(shí)有所回升。林旋豪[26]開展了類似研究，卻發(fā)現(xiàn)40%能量限制1個(gè)月后LH水平與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)。這提示，若要嘗試用食物限制的方法造模FHA，其造模強(qiáng)度和時(shí)長需要進(jìn)一步探索。

3 運(yùn)動(dòng)疲勞

3.1 造模方式及應(yīng)用

3.1.1 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)

跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)是常見的強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)的方法之一，通過長期遞增負(fù)荷的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以使動(dòng)物進(jìn)入并長期處于運(yùn)動(dòng)疲勞狀態(tài)。一般而言，研究者會(huì)通過定時(shí)增加跑步時(shí)間、跑臺(tái)速度、跑臺(tái)坡度來增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷量，從而達(dá)到造模效果。

鄭陸等[27]依據(jù)此法造模發(fā)現(xiàn)，長期遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的大鼠其動(dòng)情周期逐漸紊亂，其下丘腦GnRH、血清LH、E2、孕酮(P)、睪酮(T)水平均隨著運(yùn)動(dòng)周數(shù)的增長逐漸下降，自第7周開始均有顯著差距，至第9周達(dá)到最低值(P<0.05)；而血清FSH水平雖有下降的趨勢(shì)，但始終與對(duì)照組相比無明顯差距(P>0.05)。王人衛(wèi)等[28]進(jìn)行了相似研究，通過血清學(xué)檢測(cè)獲得類似結(jié)果，但他們同時(shí)發(fā)現(xiàn)長期遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，大鼠下丘腦及血漿中的β-內(nèi)啡肽(β-EP)顯著增高(P<0.05)，下丘腦弓狀核神經(jīng)元軸突髓鞘分離、樹突腫脹、核周質(zhì)線粒體空泡變，這說明這一造模方式確實(shí)能在下丘腦層面引起病理變化。

3.1.2 強(qiáng)迫游泳

強(qiáng)迫游泳也能造成實(shí)驗(yàn)對(duì)象運(yùn)動(dòng)疲勞狀態(tài)。其基本原理是利用實(shí)驗(yàn)對(duì)象的恐水特性，強(qiáng)迫其進(jìn)行游泳活動(dòng)，使其力量便逐漸衰竭，重復(fù)這一過程就能達(dá)到運(yùn)動(dòng)疲勞狀態(tài)。以大鼠強(qiáng)迫游泳為例[29-31]，通常其水深必須在大鼠全長的1.5倍以上；水溫需要控制在一定范圍內(nèi)；為加快其力量耗竭，可在大鼠尾部懸掛重物，質(zhì)量為3%～5%大鼠體重；當(dāng)大鼠游泳動(dòng)作明顯失調(diào)，沉入水面以下10 s未能浮出水面，則判定為力竭，立即撈出，撈出后必須擦干身體，然后放回原鼠籠。多項(xiàng)研究表明[31-32]，應(yīng)用此法造模3周，能使得雌性大鼠FSH、LH、E2、P、T水平均顯著下降；周圓[29]使用類似方法，造模6周后所有大鼠動(dòng)情周期消失。而另有研究[33]表明，強(qiáng)迫游泳致動(dòng)情周期紊亂的大鼠，其下丘腦多種單胺類遞質(zhì)水平顯著下調(diào)，如多巴胺、5-羥色胺等，而這些遞質(zhì)與下丘腦GnRH的脈沖分泌密切相關(guān)。

3.2 模型評(píng)價(jià)

兩種運(yùn)動(dòng)造模方法相較而言，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)造?？倳r(shí)長似乎比強(qiáng)迫游泳更長，但跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)造模的優(yōu)勢(shì)在于實(shí)驗(yàn)條件更易于控制，包括跑臺(tái)的坡度、跑臺(tái)的速度等可以精準(zhǔn)地調(diào)節(jié)。相比之下，強(qiáng)迫游泳的水溫、懸掛重物都難以精準(zhǔn)控制。并且實(shí)驗(yàn)條件的控制各研究均不完全統(tǒng)一，比如水溫的控制，在20～34 ℃區(qū)間內(nèi)，浮動(dòng)較大；是否懸掛重物，懸掛重物質(zhì)量的大小也沒有統(tǒng)一。這些因素對(duì)于游泳達(dá)到力竭狀態(tài)的時(shí)長均有很大影響。同時(shí)，有很多研究[29-31]報(bào)道，強(qiáng)迫游泳至力竭對(duì)卵巢有直接損傷，包括卵巢形態(tài)學(xué)的改變和對(duì)卵泡細(xì)胞的影響。

4 多因素復(fù)合

4.1 造模方式及應(yīng)用

利用心理應(yīng)激加上能量限制復(fù)合因素，或許能更好地達(dá)到造模目的。胡文曉等[34]利用束縛加食物限制的方法制造神經(jīng)性厭食癥模型，他們將大鼠每日束縛2 h，定時(shí)移除飼料和水2.5 h。造模35 d后，其動(dòng)情周期紊亂率達(dá)100%，血清E2、FSH、LH水平顯著低于對(duì)照組，其下丘腦β-EP水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

還有研究者[35]將心理應(yīng)激與運(yùn)動(dòng)疲勞相結(jié)合進(jìn)行造模，利用束縛+游泳+晝夜顛倒+空瓶刺激雌性大鼠，每日游泳30 min，束縛60 min，隔日進(jìn)行1次晝夜顛倒(白天置于黑暗環(huán)境。夜晚給予模擬的日光照明)，隨機(jī)給與空瓶刺激(每籠2個(gè)水瓶，隨機(jī)撤去其中0～2個(gè)水瓶中的水)。造模46 d后，動(dòng)情間期明顯延長，血清LH、FSH，以及下丘腦GnRH顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

此外，BETHEA等[36]將心理應(yīng)激、能量限制、運(yùn)動(dòng)疲勞三者結(jié)合，以食蟹獼猴為研究對(duì)象進(jìn)行FHA造模。通過將獼猴單獨(dú)移動(dòng)至陌生環(huán)境，使其被陌生動(dòng)物包圍模擬心理應(yīng)激；減少其每日進(jìn)食量的20%達(dá)到能量限制；將獼猴置于封閉跑步機(jī)內(nèi)強(qiáng)迫其以80%最大速度奔跑1 h，每周跑步運(yùn)動(dòng)5 d，從而造成運(yùn)動(dòng)疲勞。實(shí)驗(yàn)分5個(gè)周期進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)周期持續(xù)一個(gè)完整的月經(jīng)周期。第1個(gè)周期是完全空白對(duì)照，不做任何處理；第2個(gè)周期是對(duì)跑步機(jī)的學(xué)習(xí)訓(xùn)練；第3個(gè)周期開始造模；第4個(gè)周期仍然是造模，不過模擬心理應(yīng)激的陌生環(huán)境被更換；第5個(gè)周期是無應(yīng)激的恢復(fù)期。結(jié)果有1/3獼猴于第3個(gè)周期結(jié)束時(shí)沒有月經(jīng)，1/3獼猴于第4個(gè)周期結(jié)束時(shí)沒有月經(jīng)。并且通過對(duì)整個(gè)月經(jīng)周期血清學(xué)的監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)獼猴的雌、孕激素周期性的升高消失。進(jìn)一步對(duì)獼猴下丘腦進(jìn)行神經(jīng)生物學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)月經(jīng)消失的獼猴其下丘腦弓狀核與正中隆起處的表達(dá)GnRH的神經(jīng)元數(shù)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

4.2 模型評(píng)價(jià)

從FHA的病因上看，復(fù)合因素造模更為貼合臨床FHA患者的病史特征，多重因素的復(fù)合應(yīng)激造模應(yīng)該更容易成功造模，但這些復(fù)合造模法并沒有表現(xiàn)出比單一因素造模更好的造模效果或更優(yōu)的造模流程。同時(shí)，多種因素的復(fù)合意味著更多無關(guān)變量的增加，實(shí)驗(yàn)條件的控制更難。

5 結(jié)語

成功制造FHA動(dòng)物模型須緊緊圍繞FHA的三大誘因：即心理壓力、過度疲勞運(yùn)動(dòng)，能量攝入不足。心理應(yīng)激主要是激活機(jī)體的HPA軸，而HPA軸的過度激活與HPO軸的抑制密切相關(guān)[37]，并且這一特征與FHA患者的臨床觀察指標(biāo)相一致[38-39]，而在能量限制的造模中，通常血清CORT也會(huì)顯著升高[40-41]。相比之下，運(yùn)動(dòng)疲勞造模法則不完全一樣，運(yùn)動(dòng)和限食對(duì)于HPA的影響更為復(fù)雜。比如，有研究[42]發(fā)現(xiàn)負(fù)重游泳的大鼠，2周后，其下丘腦CRH，垂體ACTH，血清CORT均顯著降低，HPA軸被抑制,在使用過度運(yùn)動(dòng)法造模時(shí)需要注意這一問題。

此外，使用心理應(yīng)激與過度運(yùn)動(dòng)應(yīng)激應(yīng)該注意應(yīng)激強(qiáng)度和造模時(shí)長的控制，過長的造模時(shí)長與過強(qiáng)的應(yīng)激強(qiáng)度都會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的卵巢嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致FSH不降反升，目前尚未在能量限制造模中發(fā)現(xiàn)這一問題；并且諸多研究[40,43]發(fā)現(xiàn),長時(shí)間限食對(duì)大鼠卵巢生殖壽命還有一定的延長作用，較低程度的限食能使30%的大鼠限食93 d后，較對(duì)照組的卵巢原始卵泡明顯更多，卵巢儲(chǔ)備增加；而20%限食的大鼠不僅能增加卵巢儲(chǔ)備，還能維持正常生殖功能。