星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤分泌一氧化氮促進(jìn)炎性水腫帶相關(guān)腫瘤微環(huán)境的研究*

李春濤 張其健 張李洋 付思祺曾 瑜**

（1）中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)外科，長沙 410008；2）中南大學(xué)湘雅醫(yī)院傷口中心，長沙 410008；3）中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院皮膚科，表觀遺傳湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410011；4）國家老年病學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，長沙 410008）

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，根據(jù)WHO病理分級(jí)分為I~IV級(jí)［1］。隨著影像學(xué)的發(fā)展，磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像（diffusionweighted imaging，DWI）能更清楚地區(qū)分腫瘤組織、水腫組織及正常的腦組織。對(duì)于低級(jí)別的膠質(zhì)瘤，磁共振波譜分析（magnetic resonance spectroscopy，MRS）提示腫瘤組織的萘乙酸（1-naphthylacetic acid，NAA）和膽堿（choline，Cho）比值顯著高于瘤周水腫組織［2］。而膠質(zhì)瘤侵襲的范圍已遠(yuǎn)超出影像所顯示的腫瘤邊界。目前認(rèn)為，膠質(zhì)瘤相關(guān)的水腫，尤其是瘤周的腦水腫促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲，并顯著影響膠質(zhì)瘤的預(yù)后［3］。炎癥所導(dǎo)致的膠質(zhì)瘤微環(huán)境變化與膠質(zhì)瘤的生長與治療相關(guān)［3-4］。因此，膠質(zhì)瘤手術(shù)切除后周圍水腫組織是膠質(zhì)瘤治療與預(yù)后的重要研究方向。前期研究通過對(duì)大樣本臨床病例檢測(cè)誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS），發(fā)現(xiàn)iNOS的表達(dá)情況不僅與惡性腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而且惡性腫瘤顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的病例中，轉(zhuǎn)移灶明顯呈現(xiàn)iNOS高表達(dá)［5］。本研究擬通過對(duì)膠質(zhì)瘤臨床病例的腫瘤組織和水腫帶中蛋白質(zhì)及一氧化氮（nitric oxide，NO）的檢測(cè)和標(biāo)定，探討星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤分泌NO促進(jìn)炎性水腫帶相關(guān)腫瘤微環(huán)境的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo Finigan TSQ Quantum Discovery Max型液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，Xcalibur高級(jí)色譜工作站（賽默飛，美國）。Mettler電子天平（梅托勒，瑞士）；AllegraTM 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（貝克曼，美國）；渦旋混合器（賽默飛，美國）；TTL-30超純水器（北京同泰聯(lián)，中國）。甲醇為色譜純，甲酸為分析純，超純水（TTL-30超純水器自制），氯化胺緩沖液，硫酸鋅溶液（0.42 mol/L），乙酸鋅溶液，10.6%亞鐵氰化鉀溶液；氫氧化鈉溶液（20 g/L），對(duì)氨基苯磺胺酸溶液，N-1-萘基乙二胺溶液（1 g/L），以上試劑均購自德國默克公司。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液配置：準(zhǔn)確稱取250 mg于硅膠干燥器中干燥24 h的亞硝酸鈉，加水溶解移入500 ml容量瓶中，加100 ml氯化銨緩沖液，加水稀釋至刻度混勻，在4℃避光保存。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液：臨用前，吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml，置于100 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度此溶液每毫升相當(dāng)于5 μg亞硝酸鈉。顯色劑：臨用前將N-1-萘基乙二胺溶液（1 g/L）和對(duì)氨基苯磺胺酸溶液等體積混合。

1.2 膠質(zhì)瘤患者標(biāo)本的收集和準(zhǔn)備

選取2018年1月至2020年1月中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)外科診治的初次手術(shù)且術(shù)前未進(jìn)行放化療等特殊處理、術(shù)后經(jīng)病理檢驗(yàn)證實(shí)為星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的標(biāo)本27例（WHO II級(jí)10例、II-III級(jí)7例、IV級(jí)10例）。所有患者均簽署知情同意書并獲得了中南大學(xué)湘雅醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No.201703478）。取腫瘤水腫帶組織加入生理鹽水，采用組織勻漿器制成濃度為0.5 kg/L的組織勻漿，加入內(nèi)標(biāo)30 μl，渦旋后，加入乙醚-正己烷（4∶1）4 ml，渦旋3 min，3 500 r/min離心10 min。吸取上層有機(jī)相于另一離心管中，40℃水浴氮?dú)獯蹈?；下層液體再加入有機(jī)溶劑4 ml（乙醚-正己烷4∶1）提取，得到有機(jī)相，合并兩次有機(jī)相，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00μl流動(dòng)相溶解，取10μl進(jìn)樣分析。所有樣本均進(jìn)行NO檢測(cè)。

1.3 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）條件

色譜柱為Lichrospher C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨=70∶30；流速：0.2 ml/min；柱溫：35℃，進(jìn)樣量10μl。質(zhì)譜條件：離子檢測(cè)方式為選擇性離子檢測(cè)（SRM）；離子極性為正離子；離子化方式為氣動(dòng)輔助電噴霧離子化（ESI）；以多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)方式檢測(cè)。每個(gè)級(jí)別取5例樣本進(jìn)行質(zhì)譜分析。所有的測(cè)定值均在正離子模式下檢測(cè)，一級(jí)掃描MS 8 100 amu/s，二級(jí)掃描MS 26 000 amu/s。質(zhì)譜鑒定的結(jié)果在DateAnalysis處理后，采用Mascot軟件搜庫。

1.4 格里斯試劑比色法（Griess reagent）

稱取約10 g經(jīng)絞碎混勻腫瘤水腫帶樣品，置于打碎機(jī)中，加70 ml水和12 ml氫氧化鈉溶液（20 g/L），混勻，用氫氧化鈉溶液（20 g/L）或鹽酸溶液（6 mol/L）調(diào)樣品pH=8.0，定量轉(zhuǎn)移至200 ml容量瓶中，加10 ml硫酸鋅溶液，混勻，如不產(chǎn)生白色深沉，再補(bǔ)加2~5 ml氫氧化鈉，混勻。置60℃水浴中加熱10 min，取出后冷至室溫，加水至刻度混勻。放置0.5 h，濾紙過濾，棄去初濾液20 ml，收集濾液備用。吸取10 ml上述濾液于25 ml帶塞比色管中，于管中分別加入4.5 ml氯化銨緩沖液，加2.5 ml 60%乙酸后立即加入5 ml顯色劑，加水至刻度，混勻，在暗處靜置25 min，用1 cm比色杯（靈敏度低時(shí)可換2 cm比色杯），以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于波長550 nm處測(cè)吸光度。同時(shí)做試劑空白。

1.5 信號(hào)通路預(yù)測(cè)

通 過ClusterProfiler包 以 及Proteomaps和Metascape網(wǎng)頁工具進(jìn)行富集分析，分析BioCarta、KEGG通路和GO功能注釋，根據(jù)HPLC-MS/MS結(jié)果，使用上述方法對(duì)蛋白質(zhì)或?qū)?yīng)的基因集進(jìn)行富集分析，得到富集的功能注釋及通路結(jié)果。

1.6 量化和統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)值均以平均值±SEM表示。兩組數(shù)據(jù)的比較使用Student-t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05被認(rèn)為是顯著的。

2 結(jié) 果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤水腫帶中富含炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)

磁共振成像顯示15例代表性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者水腫帶，黃色圓圈為手術(shù)取材部位（圖1）。高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)上述15例星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者水腫帶組織成分，提示其富含大量炎性蛋白質(zhì)，隨著腫瘤病理級(jí)別的升高，色譜質(zhì)譜波峰更多，提示高級(jí)別星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤水腫帶中蛋白質(zhì)成分更復(fù)雜（圖2a）。這些蛋白質(zhì)中和炎癥相關(guān)的代表性蛋白質(zhì)包括：細(xì)胞色素C氧化酶（cytochrome coxidase，COX）、熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）、CD44抗 原、白 介 素-8（interleukin-8，IL-8）、白介素-24（interleukin-24，IL-24），凝溶膠蛋白（gelsolin，GSN）、應(yīng)激誘導(dǎo)磷酸蛋白1（stress-induced-phosphoprotein 1，STIP1）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、硫氧還蛋白過氧化物酶（peroxiredoxin，PRDX）、S100蛋白、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等（圖2b）。

Fig.1 The edema zone and sampling position of patientsThe magnetic resonance imaging(MRI)edema zone of WHO grade II,II-III,IV astrocytoma patients and sampling position(yellow circle).

Fig.2 The protomics analysis of astrocytoma by HPLC-MS/MS

2.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中NO的含量高于水腫帶

通過對(duì)所有星形膠質(zhì)瘤臨床病例的腫瘤組織和水腫帶中NO的檢測(cè)和標(biāo)定，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中NO的含量高于水腫帶，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.000 5）（圖3）。

Fig.3 The nitric oxide expression in 27 cases of astrocytoma edema zone and tumor tissues

2.3 HPLC-MS/MS結(jié)果的富集分析

基于HPLC-MS/MS的結(jié)果，通過多種方法對(duì)結(jié)果蛋白質(zhì)/基因進(jìn)行了富集分析。BioCarta基因集提示這些蛋白質(zhì)高度參與檸檬酸代謝途徑（citric acid/KREB pathway）。與II-III級(jí)別星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤相比，Ⅳ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤水腫帶中的基因更多地參與無氧代謝，如糖酵解（glycolysis）。更重要的是，這些目標(biāo)基因顯著參與多種氧化還原反應(yīng)，如氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）和過氧化物酶活性（peroxiredoxin activity）。誘導(dǎo)性一氧化氮合酶負(fù)責(zé)催化L-精氨酸和分子氧反應(yīng)產(chǎn)生NO。NO作為一種信使分子，在全身發(fā)揮不同的功能。并可介導(dǎo)環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）等細(xì)胞質(zhì)靶蛋白的半胱氨酸S-亞硝基化。NO分子和NO合成代謝過程中生成的NO2、NO2-、NO3-和過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion，ONOO-）等含氮自由基，被統(tǒng)稱為反應(yīng)性氮代謝物。其中，iNOS、NO、ONOO-以及SOD1在氧化還原反應(yīng)中發(fā)揮重要作用（圖4）。

Fig.4 Gene functional analysis

3 討 論

3.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤周圍的水腫帶是腫瘤引起炎癥反應(yīng)改造的微環(huán)境

Wang等［3］分析了22例膠質(zhì)瘤水腫帶的組織病理學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)水腫組織的主要成分是分散的侵襲性腫瘤細(xì)胞、反應(yīng)性細(xì)胞和各種血管組織。高級(jí)別膠質(zhì)瘤的侵襲性腫瘤細(xì)胞密度顯著高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤，且靠近膠質(zhì)瘤區(qū)域的腫瘤細(xì)胞密度顯著高于遠(yuǎn)離膠質(zhì)瘤區(qū)域的腫瘤細(xì)胞密度。瘤周水腫帶是腫瘤細(xì)胞侵襲導(dǎo)致的組織重建的結(jié)果，是膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和擴(kuò)散的合適生態(tài)位，膠質(zhì)瘤是沿著神經(jīng)纖維束浸潤和播散的［6］。Henderson等［7］發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的浸潤和水腫經(jīng)常難以完全區(qū)分，他們使用DTI數(shù)據(jù)可以區(qū)分水腫和低度惡性腫瘤（敏感性91.7%，特異性86.4%），提出了一種基于多DTI參數(shù)補(bǔ)充信息和空間歸一化的腫瘤浸潤概率圖。該課題組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種水腫校正方法可以改善膠質(zhì)瘤相關(guān)瘤周水腫患者神經(jīng)纖維運(yùn)動(dòng)束和語言束的可視化［8］，這在一定程度上可以幫助醫(yī)生更好地切除腫瘤。因此，膠質(zhì)瘤周圍的水腫帶，是腫瘤細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)形成的一種有助于腫瘤浸潤的微環(huán)境。

3.2 合成和分泌NO是星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞改造周圍炎性腫瘤微環(huán)境的重要方式

NO是機(jī)體內(nèi)的重要信使分子和效應(yīng)分子，不僅參與眾多生理過程，還可通過影響腫瘤抗藥性、逃避凋亡、促進(jìn)增殖、促進(jìn)血管新生等效應(yīng)發(fā)揮促瘤作用［9］。NO的作用十分復(fù)雜，可影響腫瘤的生物學(xué)行為與炎癥反應(yīng)，有時(shí)候呈促進(jìn)作用而有時(shí)呈抑制作用［10］。這種抗腫瘤和促腫瘤的雙重關(guān)系被認(rèn)為是濃度依賴性的，也取決于細(xì)胞的類型與細(xì)胞的生存環(huán)境［11-12］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和疾病中，高劑量的NO釋放，能導(dǎo)致ONOO-和其他活性氮自由基的形成，二者可以使蛋白質(zhì)的酪氨酸硝基化，形成3-硝基酪氨酸（3NY），引起細(xì)胞的死亡［13］。

利用經(jīng)典的格里斯試劑檢測(cè)亞硝酸鹽含量，證實(shí)在膠質(zhì)瘤的腫瘤組織及水腫帶中存在NO。膠質(zhì)瘤的腫瘤組織中NO含量高于周圍水腫帶，從側(cè)面證實(shí)腫瘤細(xì)胞中的一氧化氮合酶的活性是明顯高于腫瘤周圍組織的。這一結(jié)果與Lam-Himlin等［14］的研究一致。課題組前期發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，在其他惡性腫瘤（肺癌）的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移病例中，iNOS與惡性腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且在腫瘤顱內(nèi)轉(zhuǎn)移灶呈現(xiàn)高表達(dá)［5］。NOS廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，目前已發(fā)現(xiàn)存在3個(gè)亞型：神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial NOS，eNOS）以及iNOS［15］。在炎癥反應(yīng)中，NO主要由激活的iNOS合成產(chǎn)生［16］。iNOS在炎癥和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制中，及膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程中，發(fā)揮重要的作用［16-17］。iNOS誘導(dǎo)參與多種癌癥的惡性增殖和腫瘤進(jìn)展，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。iNOS是星形膠質(zhì)細(xì)胞惡性激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它可以誘發(fā)神經(jīng)炎癥和膠質(zhì)瘤生成［17］。本課題組在對(duì)不同分級(jí)的星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的水腫帶，進(jìn)行蛋白質(zhì)組的研究中，均發(fā)現(xiàn)有SOD-1的表達(dá)存在。SOD-1是一種含量豐富的32 ku同二聚體抗氧化酶，能將超氧化物轉(zhuǎn)化為過氧化氫。SOD-1的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度成反比［18］，過表達(dá)SOD-1能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長、抑制其凋亡［19］。

Kato等［20］研究發(fā)現(xiàn)，41例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中16例免疫組化陽性，iNOS陽性的樣本常常SOD1或SOD2陽性，尤其是iNOS的表達(dá)和SOD1的表達(dá)顯著相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)NO可以通過抑制半胱氨酸依賴的SOD1單體化來增強(qiáng)SOD1活性并抑制氧化應(yīng)激［21］。另外，科學(xué)家們也發(fā)現(xiàn)NO對(duì)血管細(xì)胞中氧化還原環(huán)境的影響，NO可快速刺激血管細(xì)胞中SOD-1基因的表達(dá)，進(jìn)而引起SOD-1蛋白的高表達(dá)，伴隨氧化應(yīng)激分子標(biāo)志的表達(dá)和O2-水平的下降。升高的SOD-1還抵消了NO抗細(xì)胞增殖的效應(yīng)。但是，這種SOD-1蛋白水平在內(nèi)皮細(xì)胞和外膜成纖維細(xì)胞中并未增加［22］。這說明，NO對(duì)于SOD-1的影響在不同細(xì)胞中亦有所不同［23］。另外，在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中SOD-1蛋白表達(dá)水平低，這與放療后的膠質(zhì)瘤SOD-1的高表達(dá)形成對(duì)比。體外實(shí)驗(yàn)中人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251的抗輻射變異也表現(xiàn)出較高的SOD-1表達(dá)［24］。

細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶5（cyclindependent kinase 5，Cdk5）在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及成熟階段，通過磷酸化細(xì)胞骨架蛋白、信號(hào)分子以及調(diào)節(jié)蛋白等眾多底物蛋白的特異性絲/蘇氨酸位點(diǎn)，而在神經(jīng)元的遷移分化、存活和突觸的發(fā)生、信息傳遞、可塑性等諸多方面起到了重要的作用。單體Cdk5無活性，需要與p35等因子結(jié)合才能被激活，Cdk5特異性磷酸化其底物蛋白的絲氨酸和蘇氨酸位點(diǎn)［25］。在如炎癥、氧化應(yīng)激和興奮性毒性刺激等促發(fā)鈣穩(wěn)態(tài)失衡或興奮性毒性的情況下，p35可被特定蛋白酶（如鈣蛋白酶（calpain））剪切，失去錨定在細(xì)胞膜上的氨基端序列，形成半衰期更長的p25［26-27］，Cdk5與p25結(jié)合，形成的復(fù)合體主要是使細(xì)胞骨架蛋白異常磷酸化，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡［27-28］。而SOD-1可以通過抑制Cdk5/p35通路，來維持神經(jīng)元細(xì)胞骨架的完整性［29］。結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析，提示星形膠質(zhì)瘤中腫瘤細(xì)胞有可能是通過iNOS-NO-ONOO--SOD-1細(xì)胞死亡來改造腫瘤周圍微環(huán)境。

本研究具有一定的局限性。首先，樣本量偏少，一共只有27例，質(zhì)譜分析各個(gè)級(jí)別只選取了5例作為代表性樣本。其次，生物信息學(xué)分析的結(jié)果和作用機(jī)制需要進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

綜上所述，星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的腫瘤周邊水腫帶，可能是腫瘤細(xì)胞對(duì)周圍微環(huán)境的一種主動(dòng)改造。腫瘤細(xì)胞通過高表達(dá)iNOS，合成并對(duì)外分泌大量的NO，NO形成的ONOO-將周圍腦組織的組織間隙、神經(jīng)元等細(xì)胞中的SOD-1消耗，產(chǎn)生過氧化細(xì)胞毒性，形成利于腫瘤細(xì)胞生長和侵襲的炎性腫瘤微環(huán)境。

4 結(jié) 論

星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤周圍水腫帶的形成是炎癥反應(yīng)的結(jié)果，膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過分泌NO調(diào)控SOD-1等炎性分子促進(jìn)侵襲性炎性腫瘤微環(huán)境的形成。