浙貝母花醇提物體內抗氧化作用研究*

胡華杰 郭燕娜 周國兒# 張雷芳

1 舟山市中醫(yī)院 浙江 舟山 316000

2 浙江海洋大學 浙江 舟山 316000

長期以來，浙貝母植株都是以鱗莖入藥，其花和地上部分常常被作為廢物丟棄[1]。近年來，研究陸續(xù)發(fā)現浙貝母花除含有與其鱗莖中相似的生物活性物質如生物堿和皂苷外，還含有黃酮類、脂肪酸、氨基酸等成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[2-4]。此外，體外實驗還發(fā)現其具有潛在的抗氧化和抗自由基作用[5]，具有廣闊的資源利用空間。如果對這些廢棄的浙貝母花資源進行開發(fā)利用，不僅可以有效提高浙貝母的利用率，而且能大大增加種植浙貝母的農業(yè)收益，提高人們的種植積極性，對于傳統(tǒng)中藥開發(fā)和發(fā)展也具有借鑒意義。

本研究以浙貝母花乙醇提取物為研究對象，初步探討其體內抗氧化作用，為浙貝母花的臨床應用提供理論依據，也為后期深入研究浙貝母花抗氧化作用的有效成分奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器：水流抽氣機A-1000S、旋轉蒸發(fā)儀N-1100均購自上海愛朗儀器有限公司；紫外可見分光光度計UV-1600購自上海美譜達儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱DGG-9240 A購自上海森信實驗儀器有限公司；落地式超純水機UPT-II-60L購自上海四科儀器設備有限公司；電磁爐C21-RH2014購自美的電器集團有限公司；渦旋振蕩器Votlex-genie 2購自上海革冉儀器設備有限公司。

1.2 試劑：浙貝母花采自浙江省舟山市金塘鎮(zhèn)，經鑒定為百合科貝母屬植物浙貝母（Fritillariae thunbergii Miq.）的花；維生素C（批號：ST1434）、考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司；硫酸亞鐵、葡萄糖、氯化鈉、無水乙醇、碳酸鈣均購自國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 浙貝母花乙醇提取物的制備：稱取自然干燥后粉碎的浙貝母花100g，加800mL 70%乙醇超聲波提取3次，每次3h，抽濾，合并濾液，在減壓條件下回收乙醇，烘干，即為浙貝母花乙醇提取物。

2.2 DPPH自由基清除率的測定：稱取4.0mg的DPPH，加無水乙醇溶解，置100mL棕色容量瓶中，制備得到濃度為0.08mol/L的DPPH溶液，避光保存?zhèn)溆?。分別吸取不同濃度(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，單位：mg/mL)的樣品溶液2.0mL到10mL的離心管中，再分別加入3.0mLDPPH溶液，在室溫、避光條件下反應30min，蒸餾水為空白對照組，于517nm波長處分別測定它們的吸光值，計算DPPH自由基清除率，公式如下。實驗重復3次，求平均值。

DPPH自由基清除率(%)=［A0-(AS-AC)］/A0×100%

A0：2.0mL蒸餾水+3.0mL DPPH溶液的吸光度值

AS：2.0mL樣品溶液+3.0mL DPPH溶液的吸光度值

AC：2.0mL樣品溶液+3.0mL蒸餾水的吸光度值

2.3 動物分組及給藥：ICR小鼠50只，雄性，體質量28～30g(杭州子源實驗動物科技有限公司，合格證編號：20210412Abzz0105999541)，在標準環(huán)境條件下(24±2℃溫度、75%濕度和12h光-暗循環(huán))飼養(yǎng)一周，自由進食、飲水。將小鼠隨機分為正常組、陽性對照（VC）組和浙貝母花乙醇提取物高劑量組（0.8g/kg）、中劑量組（0.4g/kg）及低劑量組（0.2g/kg），每組10只。將浙貝母花乙醇提取物的干浸膏用少量0.5%CMC-Na溶解后，加入去離子水配成懸浮液進行灌胃給藥，1次/d。陽性組使用0.03g/kg的維生素C進行灌胃，正常組使用等體積的0.5%CMC-Na水溶液灌胃，連續(xù)給藥14d。

2.4 血清及肝、腦組織勻漿的制備：實驗最后一次給藥24h之后，眼球取血，3500rpm離心15min，分離得上層血清用于進一步分析?？焖賹⑿∈筇幩啦⒔馄?，剝離得到肝臟以及腦組織，使用預冷的生理鹽水對肝臟及腦組織沖洗數次，放置于白色操作臺上拍照取證，再用其制成濃度為10%的組織勻漿，3500rpm離心10min，分離得上層血清用于進一步分析。

2.5 抗氧化指標的測定：按照相應的試劑盒說明書測定小鼠血清、腦組織、肝組織勻漿中的T-SOD、MDA、CAT、GSH-PX含量。

2.6 統(tǒng)計學處理：實驗結果用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學處理，多組間比較采用單因素方差分析，各組數據均以（±s）表示，當P＜0.05時，具有統(tǒng)計學意義。

2.7 體外DPPH自由基的清除率：由圖1可知，浙貝母花乙醇提取物對DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加而增加，兩者呈正比關系。當濃度為0.8mg/mL時，清除率超過50%。當濃度為1.0mg/mL時清除率達到了59.28%。結果表明，浙貝母花乙醇提取物具有較好的體外自由基清除力，并具有潛在的體內抗氧化活性。

圖1 不同濃度浙貝母花乙醇提取物對DPPH自由基的清除率

2.8 浙貝母花乙醇提取物對小鼠血清中T-SOD、MDA、CAT和GSH-PX影響：由圖2可知，浙貝母花的乙醇提取物可以顯著提高小鼠血清中的T-SOD、CAT和GSH-PX活性，降低MDA的水平，且中、高劑量組改善最為明顯（P＜0.05）。

圖2 浙貝母花乙醇提取物對小鼠血清中T-SOD、MDA、CAT、GSH-PX的影響

2.9 浙貝母花乙醇提取物對小鼠腦組織中T-SOD、MDA、CAT和GSH-PX的影響：由圖3可知，浙貝母花乙醇提取物能夠提高小鼠腦組織中的T-SOD、CAT和GSH-PX的活性，降低MDA的水平，且中、高劑量組的改善更明顯（P＜0.05）。

圖3 浙貝母花乙醇提取物對小鼠腦中T-SOD、MDA、CAT、GSH-PX的影響

2.10 浙貝母花乙醇提取物對小鼠肝組織中T-SOD、MDA、CAT和GSH-PX活性水平的影響：由圖4可知，浙貝母花的乙醇提取物可以提高小鼠肝組織中的T-SOD、CAT和GSH-PX活性，降低MDA的水平，且中、高劑量組改善更明顯（P＜0.05）。

圖4 浙貝母花乙醇提取物對小鼠肝臟中T-SOD、MDA、CAT、GSH-PX的影響

3 討論

正常情況下，機體內自由基處于一個動態(tài)平衡狀態(tài)，但如果自由基產生過快或清除過慢，就會對機體造成傷害，甚至會誘發(fā)諸多疾病，例如癌癥、類風濕性關節(jié)炎、心血管疾病、糖尿病以及與衰老相關的退行性過程[6-10]。抗氧化劑能夠有效地清除自由基，使機體免受自由基的損傷，受到廣泛應用。目前所使用的抗氧化劑多是人工合成，攝入過多會產生毒副作用，存在安全隱患[11]。天然抗氧化劑由于對機體的安全性高、無副作用且自身抗氧化能力強等特點愈來愈受到重視[12]，因此從植物中研究提取天然抗氧化劑具有重要意義。

DPPH是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，它的穩(wěn)定性主要來自3個苯環(huán)的π-π共軛作用及空間障礙，使夾在中間的氮原子上不成對的電子不能發(fā)揮其應有的電子成對作用。作為一種穩(wěn)定的自由基，DPPH可以捕獲其他的自由基。因此通過加入DPPH后觀察某一化學反應的速率是否減慢，來作為這一反應是否具有自由基反應本質的指標。

本實驗中我們利用超聲提取法制備浙貝母花乙醇提取物，測定了DPPH自由基的清除率，通過體內實驗對其抗氧化作用進行了初步研究。實驗結果顯示，浙貝母花乙醇提取物具有較好的體外自由基清除力，中、高劑量組能夠降低小鼠血清、肝臟和腦組織中的MDA含量，升高SOD、CAT、GSH-PX的含量，具有較好的體內抗氧化活性。下一步，課題組擬對浙貝母花乙醇提取物抗氧化的作用機制和其他提取物的抗氧化作用進行研究，為浙貝母花的進一步開發(fā)利用提供可行性基礎。