基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討加味十灰散治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制*

俞雯雯 任列鈺 康年松 沈淼山 倪觀鋒 王 丹

1 余姚市中醫(yī)醫(yī)院 浙江 余姚 315400

2 浙江理工大學(xué) 浙江 杭州 310018

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種免疫介導(dǎo)的慢性、非特異性炎癥性腸病，具有易反復(fù)、難治愈等特點(diǎn)，尋找安全、有效的 UC治療藥物已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究焦點(diǎn)。UC以“腹痛”“泄瀉”“便血”為主癥，中醫(yī)將其歸屬于“痢疾”范疇，其主要病機(jī)為熱邪壅滯于腸，氣血阻滯，腸道運(yùn)化失司，脂膜血絡(luò)受損，腐敗而化為膿血為病。從UC發(fā)生發(fā)展的過(guò)程來(lái)看，“熱邪壅滯”是其關(guān)鍵，以“清熱解毒、涼血散瘀”為治則的加味十灰散（JWSHS）加減治療潰瘍性結(jié)腸炎，效果顯著[1]，但該方治療UC的具體作用機(jī)制尚不明朗。本研究將運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究JWSHS治療UC的作用機(jī)制，尋找JWSHS干預(yù)UC的潛在治療靶點(diǎn)，為其治療UC提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物活性成分篩選及潛在靶點(diǎn)獲?。和ㄟ^(guò)搜索中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP），收集JWSHS中17味中藥“大薊、小薊、仙鶴草、五倍子、五味子、牡丹皮、大黃、野菊花、白頭翁、秦皮、白及、丹參、當(dāng)歸、黃柏、黃連、黃芩、甘草”的主要成分，并以類(lèi)藥性(DL)≥0.18、口服利用度(OB)≥30%為條件篩選成藥性較好的活性成分[2]。通過(guò)Cytoscape v3.7.2繪制中藥-活性成分網(wǎng)絡(luò)圖。整理活性成分，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)搜索藥物活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，并通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.uniprot.org/)進(jìn)行靶點(diǎn)信息比對(duì)和基因名校正，限定基因來(lái)源為人源性。

1.2 疾病相關(guān)基因獲?。和ㄟ^(guò)檢索疾病相關(guān)的基因與突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.disgenet.org/）及人類(lèi)基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.genecards.org/)，輸入檢索詞為“ulcerative colitis”，合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得到的疾病靶點(diǎn)，并與藥物靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲取交集靶點(diǎn)，利用韋恩在線網(wǎng)站(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)做交集靶點(diǎn)韋恩圖。利用Cytoscape v3.7.2軟件將結(jié)果可視化，并構(gòu)建JWSHS活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建：將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（http：//string-db.org/cgi/input.pl）數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape v3.7.2，借助Cyto NCA插件中的Degree、Betweenness、Closeness等參數(shù)篩選節(jié)點(diǎn)，將連接度大于等于2倍中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)確定為關(guān)鍵靶點(diǎn)。將關(guān)鍵靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的化合物一一對(duì)應(yīng)，導(dǎo)入Cytoscape v3.7.2作圖，以度值為篩選條件，得到JWSHS治療UC的關(guān)鍵成分。

1.4 GO和KEGG分析：將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程富集(GO)分析，導(dǎo)入京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)（https：//www.kegg.jp/kegg/）進(jìn)行信號(hào)通路分析，獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)的相關(guān)生物學(xué)信息，并利用R軟件繪制氣泡圖，分析JWSHS治療UC的潛在作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 JWSHS活性成分和潛在靶點(diǎn)獲?。涸赥CMSP中搜索JWSHS活性成分，最終得到237個(gè)藥物活性成分，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得305個(gè)藥物潛在靶點(diǎn)，利用Cytoscape v3.7.2繪制中藥-活性成分網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。

圖1 JWSHS中藥-活性成分網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 UC靶點(diǎn)獲?。阂浴皍lcerative colitis”為檢索詞，在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)和Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相關(guān)基因，合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)找到的UC靶點(diǎn)，與JWSHS活性成分潛在靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比，利用韋恩在線網(wǎng)站尋找交集靶點(diǎn)，共得到159個(gè)共同基因，韋恩圖見(jiàn)圖2。將JWSHS活性成分與交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape v3.7.2將結(jié)果可視化，并構(gòu)建JWSHS活性成分—交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。

圖2 JWSHS交集靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 JWSHS活性成分—交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 核心靶點(diǎn)互作圖：構(gòu)建PPI，159個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)存在復(fù)雜的相互作用，共有159個(gè)結(jié)點(diǎn)，2824條邊，結(jié)點(diǎn)平均度值為35.5，結(jié)點(diǎn)度值的中位數(shù)為32，最大值為113，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape v3.7.2，得到加味十灰散治療UC的159個(gè)靶標(biāo)蛋白互作信息（圖4A），設(shè)置度的篩選值為兩倍中位數(shù)值14至最大值113，從交集靶點(diǎn)蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出核心靶點(diǎn)27個(gè)，分別為AKT1、IL-6、VEGFA、TP53、TNF、MAPK8、EGF、JUN、CASP3、STAT3、EGFR、PTGS2、MYC、MMP9、IL-1B、FOS、FN1、CCL2、ESR1、CCND1、NOS3、EDN1、CAT、MMP2、PPARG、IL-10和ICAM1。根據(jù)蛋白與蛋白的Degree值繪制27個(gè)核心靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)的條形圖（圖4B）。將27個(gè)核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)化合物進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，如圖5所示。根據(jù)度值篩選前10味成分為槲皮素，木犀草素，漢黃芩素，山柰酚，丹參酮IIA，黃芩素，蘆薈大黃素，柚皮素，隱丹參酮和吳茱萸次堿。

圖4 A 靶標(biāo)蛋白互作信息圖 圖4B 核心靶點(diǎn)條形圖

圖5 JWSHS有效成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO和KEGG分析：分述如下。

2.4.1 GO分析：將159個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，并限定物種來(lái)源為人源，選擇標(biāo)記欄為official gene symbol進(jìn)行檢索，設(shè)定閾值以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.01為前提，確定了258個(gè)GO條目，其中BP相關(guān)條目197個(gè)（圖6A），MF相關(guān)條目39 個(gè)（圖6B），CC相關(guān)條目22個(gè)（圖6C）。

圖6 A BP分析 圖6B MF分析 圖6C CC分析

2.4.2 KEGG分析：得到125條信號(hào)通路，根據(jù)FDR＜0.01篩選出104條，其中包括癌癥信號(hào)通路，乙型肝炎信號(hào)通路等，利用R-4.0.5進(jìn)行KEGG通路富集可視化分析，通過(guò)count、ratio和FDR來(lái)衡量KEGG富集程度，篩選并確定其中50條最具統(tǒng)計(jì)意義的通路，見(jiàn)圖7。

圖7 JWSHS作用靶點(diǎn)KEGG富集分析

3 討論

槲皮素存在于甘草、黃柏、黃連、牡丹皮、仙鶴草、小薊、野菊花中，經(jīng)文獻(xiàn)驗(yàn)證，槲皮素可靶向作用于CXCL8用于防治UC[3]。木犀草素為丹參、仙鶴草、野菊花的活性成分，已有文獻(xiàn)研究證實(shí)木犀草素可以通過(guò)SHP-1/STAT3信號(hào)通路緩解UC[4]。漢黃芩素為黃芩的主要有效成分，且小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)漢黃芩素為治療UC的血清藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[5]。腸道微生態(tài)破壞被認(rèn)為是UC的發(fā)病機(jī)理之一，研究證實(shí)，山柰酚可以通過(guò)抑制LPS-TLR4-NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，從而緩解UC相關(guān)癥狀[6]，JWSHS組方中甘草、牡丹皮、仙鶴草均含有山奈酚。丹參酮ⅡA為丹參的主要有效成分，大鼠實(shí)驗(yàn)表明，其可有效抑制UC大鼠炎性反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與有效下調(diào)結(jié)腸組織p-p38MAPK、NOXs表達(dá)相關(guān)[4]。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明黃芩素可有效減輕UC大鼠炎性反應(yīng)及結(jié)腸黏膜組織炎性病理?yè)p傷，其作用機(jī)制可能與有效上調(diào)結(jié)腸黏膜組織HSP70表達(dá)相關(guān)[7]。最新研究顯示，柚皮素可以通過(guò)miR-22抑制NLRP3炎癥小體并減輕UC大鼠模型腸屏障損傷[8]，隱丹參酮對(duì)小鼠急慢性UC有一定的治療作用[9]，吳茱萸次堿對(duì)UC小鼠有治療作用[10]。以上報(bào)道與本研究相互印證，表明JWSHS治療UC的具有一定科學(xué)性。

為深入研究JWSHS治療UC的關(guān)鍵蛋白，對(duì)預(yù)測(cè)得到的JWSHS治療UC的潛在靶標(biāo)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，AKT1、IL-6、VEGFA、TP53、TNF等基因在網(wǎng)絡(luò)中具有較高的Degree，在網(wǎng)絡(luò)中處于重要地位。Akt在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、凋亡和生存方面具有重要作用，UC模型組中AKT表達(dá)顯著升高[11]。IL-6和TNF作為重要的促炎性細(xì)胞因子，可以調(diào)控免疫炎性反應(yīng)，介導(dǎo)UC發(fā)病[6]。VEGFA也被稱(chēng)為血管通透性因子，具有誘導(dǎo)血管滲漏的能力，它誘導(dǎo)的血管通透性增強(qiáng)是其在炎癥和其他病理環(huán)境中發(fā)揮重要作用的基礎(chǔ)，研究顯示UC患者VEGF的黏膜表達(dá)水平顯著升高[12]。TP53是一種重要的抑癌基因，而UC的癌變發(fā)生率高達(dá)28%，故對(duì)TP53進(jìn)行有效調(diào)控可能是未來(lái)UC治療的方向之一。

基于KEGG代謝通路的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，JWSHS主要作用 于 Pathways in cancer，Hepatitis B，PI3K-Akt signaling pathway等通路。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路可有效抑制炎癥介質(zhì)釋放的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[13]。通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白磷酸化水平，可降低炎癥因子及蛋白的表達(dá)，從而抑制炎癥小體活化，緩解腸組織炎癥癥狀，進(jìn)而改善腸組織損傷。腫瘤信號(hào)通路涵蓋范圍較廣，與PI3K-Akt、MAPK信號(hào)通路等聯(lián)系密切，可引起基因組損傷，化療抵抗等反應(yīng)，UC癌變發(fā)生率高達(dá)28%，而腫瘤信號(hào)通路的變化與癌變發(fā)生有著高度的關(guān)聯(lián)性。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)槲皮素、木犀草素、漢黃芩素等為JWSHS主要活性成分，AKT1、IL-6、VEGFA、TP53、TNF等為主要作用靶標(biāo)，主要調(diào)控癌癥信號(hào)通路、乙肝信號(hào)通路、PI3K-Akt等通路。本研究對(duì)闡明JWSHS的作用機(jī)制具有借鑒意義，但所得結(jié)論仍需進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)或臨床驗(yàn)證。