徐佳慧，李潔華，陳潔霞，歐陽歡

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,a 全科醫(yī)學(xué)科，b 普外科,合肥 230022

頸動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄是由頸動(dòng)脈內(nèi)膜下粥樣硬化性斑塊的慢性累積引起的，有20%～30%的缺血性腦卒中或短暫性腦缺血發(fā)作與之相關(guān)[1-2]。明確頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病與進(jìn)展機(jī)制是防治腦血管意外的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展受到包括血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、慢性炎癥反應(yīng)、循環(huán)白細(xì)胞的募集、脂代謝紊亂、血管平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移在內(nèi)的多種因素的調(diào)節(jié)[3-4]。鑒于影響頸動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)因素較多，深入探索和找尋其中的關(guān)鍵調(diào)控基因及潛在信號(hào)通路具有重要意義。

基因芯片是分析基因表達(dá)的高通量平臺(tái)，已被廣泛用于研究人類疾病相關(guān)基因的表達(dá)譜。生物信息學(xué)分析可以在基因組水平上篩選出相關(guān)疾病的差異基因。然而，獨(dú)立的微陣列分析常導(dǎo)致假陽性率。本研究從基因表達(dá)公共數(shù)據(jù)庫(GEO)中下載關(guān)于研究早期和晚期頸動(dòng)脈粥樣硬化的2個(gè)微陣列數(shù)據(jù)集(GSE43292[5]、GSE28829[6])，再將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列預(yù)處理后，篩選出與頸動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展相關(guān)的差異基因。再對(duì)差異基因進(jìn)行基因本體論(GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號(hào)通路富集分析以尋找潛在的信號(hào)通路。然后，利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(STRING)和Cytoscape軟件分析差異基因的關(guān)聯(lián)性，篩選出調(diào)控頸動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的Hub基因。這項(xiàng)研究的結(jié)果或有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病與進(jìn)展的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 微陣列數(shù)據(jù)下載和處理 首先，從GEO數(shù)據(jù)庫中下載關(guān)于早期和晚期頸動(dòng)脈粥樣硬化研究的GSE28829和GSE43292這2個(gè)數(shù)據(jù)集。GSE28829是在GPL570[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺(tái)基礎(chǔ)上檢測(cè)出來的，由13個(gè)早期和16個(gè)重度病變的樣本組成。而包含32個(gè)早期和32個(gè)重度病變樣本的GSE43292使用GPL6244[HuGene-1_0-st]Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array[transcript (gene) version]平臺(tái)。然后，將下載的數(shù)據(jù)集原始文件依據(jù)其平臺(tái)提供的注釋配置文件分別進(jìn)行注釋，獲得2個(gè)基因表達(dá)矩陣文件，再將兩者合并為一個(gè)文件。利用R語言(版本3.6.3，http://r-project.org/)中的“sva”軟件包來消除合并后的表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)的批次效應(yīng)，最終得到標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)矩陣文件。用boxplot圖展示合并后的表達(dá)矩陣的批次效應(yīng)。

1.2 差異基因的篩選 差異基因的篩選是利用R語言中的“l(fā)imma”軟件包實(shí)現(xiàn)的。用Benjamini-Hochberg法校正P值，然后計(jì)算出P值的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)。基因表達(dá)的差異用差異倍數(shù)(FC)表示。本研究設(shè)定的差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|>0.585并且FDR<0.01[7]。為了展示差異基因的表達(dá)差異，分別用“ggplot2”和“pheatmap”軟件包繪制出差異基因的火山圖和重要基因的表達(dá)熱圖。

1.3 差異基因的GO功能注釋和KEGG信號(hào)通路富集分析 利用“clusterProfiler”軟件包分別對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG信號(hào)通路富集分析。其中GO功能注釋是按照生物過程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞組分(CC)3個(gè)部分對(duì)目標(biāo)基因的功能進(jìn)行注釋。KEGG是將目標(biāo)基因按照所在生物學(xué)通路進(jìn)行富集分析。以校正后的P值<0.05為界值。分析結(jié)果以氣泡圖展示。

1.4 差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與Hub基因篩選 利用 STRING(版本11.0，http:/ / string-db.org/)工具來構(gòu)建差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，探索差異基因與互作網(wǎng)絡(luò)間的關(guān)系。PPI的閾值設(shè)定為≥0.9(最高置信度)。用Cytoscape軟件(3.7.2版)來進(jìn)一步分析和可視化PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)。分別應(yīng)用 CytoHubba 中的“Degree”“Maximal Clique Centrality (MCC)”和“Maximum Neighborhood Component (MNC)”分析方法從所有差異基因中發(fā)現(xiàn)各自的特征節(jié)點(diǎn)。采用Venn圖法將各自排列前十的節(jié)點(diǎn)取交集獲得的共有基因定為Hub基因。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)處理和差異基因的篩選及分析 首先，本組用boxplot圖展示了從GSE28829和GSE43292數(shù)據(jù)集合并而來的表達(dá)矩陣的批次效應(yīng)。圖1展示了2個(gè)數(shù)據(jù)集中包含的多個(gè)樣本數(shù)據(jù)中多個(gè)基因的差異表達(dá)情況。對(duì)比圖1A與圖1B的結(jié)果可知“sva”軟件包可以很好地消除這2個(gè)不同數(shù)據(jù)集合并后的批次效應(yīng)。這說明合并后的數(shù)據(jù)具備進(jìn)一步分析處理的必要條件。然后，利用“l(fā)imma”包來分析合并后的表達(dá)矩陣文件共獲得197個(gè)表達(dá)下調(diào)和379個(gè)表達(dá)上調(diào)的差異基因，所獲結(jié)果可視化為火山圖，見圖2。用“pheatmap”包繪制差異最顯著的前15個(gè)上調(diào)和下調(diào)基因的熱圖(圖3)。其中下調(diào)的基因有TPH1、CASQ2、PLD5、CNTN1、HAND2-AS1、ACADL、ITLN1、PDE8B、SLC22A3、ANGPTL1、CNN1、FHL5、ATRNL1、SCRG1、ATP1A2；上調(diào)的基因有MMP9、MMP12、FABP4、FABP5、IGHM、CD36、MMP7、CD52、ADAMDEC1、AQP9、IGLJ3、CHI3L1、ACP5、CCL19、CCR1。

圖1 2個(gè)不同數(shù)據(jù)集合并前后的批次效應(yīng)：

圖2 數(shù)據(jù)集GSE43292與GSE28829合并后的火山圖

圖3 早期和晚期頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊之間差異最顯著的前15個(gè)上調(diào)和下調(diào)基因的熱圖

2.2 差異基因的GO功能注釋和KEGG信號(hào)通路富集分析 利用R語言“clusterProfiler”包對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析的結(jié)果見圖4。按富集基因數(shù)目排序前10的GO功能注釋結(jié)果如圖4A所示，BP途徑中差異基因主要富集于中性粒細(xì)胞活化、中性粒細(xì)胞脫顆粒及參與免疫反應(yīng)的中性粒細(xì)胞活化等與免疫、炎癥反應(yīng)的途徑；CC途徑中差異基因主要富集于分泌顆粒膜、分泌顆粒內(nèi)腔及胞質(zhì)囊腔等途徑；MF途徑中差異基因主要富集于肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白、糖結(jié)合蛋白及免疫受體活性等途徑?；贙EGG信號(hào)通路分析可見差異基因在結(jié)核病、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、吞噬小體、趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞黏附分子、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成等通路顯著富集(圖4B)。以上結(jié)果提示，免疫與炎癥反應(yīng)或在頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與進(jìn)展中起重要作用。

注：GO為基因本體論；BP為生物過程，CC為細(xì)胞組分，MF為分子功能；KEGG為京都基因與基因組百科全書。

注：紅色代表上調(diào)基因；綠色代表下調(diào)基因；PPI為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。

2.3 差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與Hub基因篩選 從STRING數(shù)據(jù)庫下載的差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)由566個(gè)節(jié)點(diǎn)和503條邊組成。經(jīng)Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析的結(jié)果如圖5所示，紅色和綠色注釋分別表示上調(diào)和下調(diào)的基因，各節(jié)點(diǎn)大小與Degree呈正相關(guān)。利用 CytoHubba 中的Degree、MCC和MNC分析方法分析得到各自排序前十的差異基因見表1。采用Venn圖法取以上3種方法獲得的基因的交集，如圖6所示，交叉部分的3個(gè)LYN、SYK和HCK是Hub基因，其對(duì)應(yīng)的蛋白可能是核心蛋白或具有重要生理調(diào)控功能的關(guān)鍵候選基因。

注：MCC為Maximal Clique Centrality；MNC為Maximum Neighborhood Component。

表1 利用Degree、MCC、MNC方法計(jì)算獲得的排列前十的基因列表

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，腦卒中已成為世界上第二大常見的致死因素，也是最普遍的致殘?jiān)蛑籟8]。頸動(dòng)脈內(nèi)膜下粥樣硬化性斑塊的慢性累積導(dǎo)致的頸動(dòng)脈粥樣硬化約占缺血性腦卒中致病因素的20%～30%[1]。因此，了解頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生與進(jìn)展的病因和分子機(jī)制對(duì)于防治腦卒中至關(guān)重要?；诨蛐酒夹g(shù)獲得的基因表達(dá)譜可用來同時(shí)比較成千上萬個(gè)基因的表達(dá)變化，而生物信息學(xué)的快速發(fā)展，使暴增的基因芯片表達(dá)譜大數(shù)據(jù)能夠得到更好地解析，也使得更多蘊(yùn)藏在大數(shù)據(jù)中的生物信息能夠被挖掘。本研究利用生物信息學(xué)分析技術(shù)對(duì)從GEO數(shù)據(jù)庫下載來的GSE28829和GSE43292這2個(gè)關(guān)于頸動(dòng)脈粥樣硬化研究的數(shù)據(jù)集進(jìn)行重注釋、合并數(shù)據(jù)并標(biāo)準(zhǔn)化處理后分析，共獲得576個(gè)差異基因，其中下調(diào)基因197個(gè)，上調(diào)基因379個(gè)；它們共同構(gòu)成了頸動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的差異基因表達(dá)譜，與頸動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展密切相關(guān)。目標(biāo)差異基因的GO功能注釋和KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示主要與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、吞噬小體、趨化因子信號(hào)通路和細(xì)胞黏附分子信號(hào)通路等有關(guān)。PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選LYN、SYK、HCK為Hub基因，可能在頸動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用。

LYN編碼一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，可以從細(xì)胞表面受體傳遞信號(hào)，在調(diào)節(jié)先天性和獲得性免疫反應(yīng)、造血、對(duì)生長因子和細(xì)胞因子的反應(yīng)、整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及對(duì)DNA損傷和遺傳毒性物質(zhì)的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。LYN是調(diào)節(jié)糖蛋白Ⅵ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要Src家族激酶，在激光損傷模型中，它的缺失導(dǎo)致激活延遲和血小板在膠原上的聚集顯著減少[9]。然而，另一項(xiàng)明顯相互矛盾的研究表明，LYN抑制了血小板的激活，并且隨著血小板聚集的進(jìn)行，LYN的活性越來越低[10]。Miki等[11]認(rèn)為LYN在血脂代謝中起重要作用，在高脂飲食的動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)展過程中可誘導(dǎo)與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的單核細(xì)胞趨化蛋白-1的表達(dá)。SYK編碼的也是非受體型酪氨酸蛋白激酶家族的成員，這種蛋白在造血細(xì)胞中廣泛表達(dá)，并參與將激活的免疫受體與下游信號(hào)事件偶聯(lián)，介導(dǎo)不同的細(xì)胞反應(yīng)，包括增殖、分化和吞噬。研究發(fā)現(xiàn)SYK可通過激活單核細(xì)胞趨化蛋白-1的表達(dá)參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病[12]。Choi等[13]發(fā)現(xiàn)SYK通過激活自噬調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞MHC-Ⅱ的表達(dá)在人類動(dòng)脈粥樣硬化的慢性炎癥中起作用。此外，SYK的抑制劑福他替尼可減輕了小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化形成，表明SYK是動(dòng)脈粥樣硬化的潛在抗感染治療靶點(diǎn)[14]。HCK是酪氨酸激酶Src家族中的一員，它傳遞膜受體信號(hào)，在免疫細(xì)胞的存活、增殖、遷移和吞噬過程中發(fā)揮重要作用[15]。另據(jù)報(bào)道，HCK可以調(diào)節(jié)炎癥小體(NOD樣受體家族蛋白3)的表達(dá)從而影響類似于動(dòng)脈粥樣硬化、多發(fā)性硬化、2型糖尿病、帕金森病等與炎癥相關(guān)的疾病[16]。此外，HCK還參與了白細(xì)胞的黏附和遷移，這可能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[17]。

本研究通過生物信息學(xué)的方法研究了與頸動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展相關(guān)的差異基因及其相關(guān)通路變化，為頸動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)；篩選出的LYN、SYK和HCK等3個(gè)Hub基因可能成為頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的潛在治療靶點(diǎn)。然而，相關(guān)基因的功能還需要進(jìn)一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。