RHO/ROCK信號通路抑制劑在奧沙利鉑化療施旺細胞損傷中的保護作用研究

李 娜，姚 娜，田 稼

目前化療已成為腫瘤治療的一種重要方法，化療不良反應(yīng)眾多，末梢神經(jīng)炎是其中較為常見的一種，被稱為化療所致的周圍神經(jīng)病變(CIPN)。報道指出,約90%癌癥患者在化療期間發(fā)生CIPN,30%患者在化療結(jié)束后仍出現(xiàn)永久性的神經(jīng)損傷[1]。但到目前為止，還沒有特定的藥物能夠預(yù)防CIPN。施旺細胞(SCs)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中一種神經(jīng)膠質(zhì)細胞，圍繞周圍神經(jīng)軸突形成髓鞘，SCs可分泌GDNF等多種神經(jīng)活性分子、為軸突提供支持、改善神經(jīng)細胞微環(huán)境，對維持神經(jīng)纖維的存活、生長及神經(jīng)損傷修復(fù)發(fā)揮了重要作用[2-3]。研究表明RHO/ROCK信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)都發(fā)揮著重要的作用，是腫瘤治療的重要靶點，同時RHO/ROCK信號通路抑制劑在支氣管哮喘、肥胖、糖尿病、冠心病、腎病等疾病的治療中有潛在應(yīng)用價值[4-6]。本文進一步研究探討了RHO/ROCK信號通路抑制劑在化療致SCs損傷中的保護作用及CIPN預(yù)防中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料：大鼠施旺細胞(BNCC341121)購自北納生物，奧沙利鉑購及RHO/ROCK信號通路抑制劑Y27632購自MCE。Bcl2 兔多克隆抗體(26593-1-AP)、BAX兔多克隆抗體(50599-2-Ig)、Caspase 3兔多克隆抗體(19677-1-AP)、TOM70 兔多克隆抗體(14528-1-AP)、OPA1 兔多克隆抗體(27733-1-AP)、DENR 兔多克隆抗體(10656-1-AP)及HRP-山羊抗兔二抗(SA00001-2)購自Proteintech 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SCs培養(yǎng):DMEM細胞培養(yǎng)液中加入10%FBS、1%雙抗，細胞培養(yǎng)條件：37℃、90%濕度、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱，每2 d 換液1次，細胞貼壁達到80%進行傳代。

1.2.2 實驗分組：取對數(shù)生長期SCs，按照細胞處理方式分為：①正常對照組:正常培養(yǎng)細胞；②奧沙利鉑處理組：SCs加入0.5 mol/mL奧沙利鉑；③抑制劑組：奧沙利鉑處理組細胞預(yù)先加入10 μmol/mL Y27632，處理48 h 后收集各組細胞進行檢測。

1.2.3 線粒體膜電位(MMP)及細胞凋亡檢測：收集3組細胞，75%無水乙醇固定30 min，PBS溶液800 g離心洗滌3次，加入配置好的細胞線粒體膜電位與細胞凋亡檢測工作液，4℃避光孵育1h后流式細胞儀檢測。

1.2.4 Western-Blot檢測：收集各組細胞用冰冷PBS洗滌3次，然后用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解，離心收集上清，用Bradford法測定細胞蛋白含量，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂乳孵育1 h，一抗[Bcl2(1∶3 000)、BAX(1∶2 000)、Caspase 3二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，PBST洗膜,ECL發(fā)光檢測。采用ImageJ 1.46程序，通過密度(1∶2 000)、TOM70(1∶2 500)、OPA1(1∶3 000)、DRP1(1∶2 000)]4℃孵育，二抗(HRP-山羊抗兔光密度，OD)法對電泳帶圖像并進行相對定量分析。

2 結(jié)果

2.1 CCK83組細胞增殖狀況檢測：與正常對照組比較，實驗組、抑制劑組24 h和48 h細胞OD值均低于正常對照組(P<0.05)；抑制劑組與實驗組比較，24 h和48 h細胞OD值抑制劑組高于實驗組(P<0.05)，見圖1(目錄后)。

2.2 3組SCs細胞凋亡檢測：與正常對照組比較，實驗組、抑制劑組細胞凋亡率高于正常對照組(P<0.05)；抑制劑組與實驗組比較，抑制劑組細胞凋亡率低于實驗組(P<0.05)。實驗組、抑制劑組與對照組比較Bcl2蛋白表達下調(diào)，Bax、Caspase3蛋白表達上調(diào)；抑制劑組與實驗組比較，BCL2蛋白表達上調(diào)，Bax和Caspase3蛋白表達下調(diào)，見圖2(目錄后)。

2.3 3組SCs細胞線粒體膜電位檢測：與正常對照組比較，實驗組、抑制劑組MMP高于正常對照組(P<0.05)，抑制劑組MMP低于實驗組(P<0.05)，見圖3(目錄后)。

2.4 3組SCs細胞線粒體結(jié)構(gòu)功能蛋白檢測：實驗組、抑制劑組與對照組比較，DRP1蛋白表達上調(diào)，OPA1、TOM70蛋白表達下調(diào)；抑制劑組與實驗組比較，DRP1蛋白表達下調(diào)，OPA1、TOM70蛋白表達下調(diào)，見圖4(目錄后)。

3 討論

CIPN是抗腫瘤藥物的主要且常見的副作用之一，常見可引起CIPN的化療藥物有鉑類(順鉑、卡鉑和奧沙利鉑)、微管蛋白抑制劑(紫杉醇)及蛋白酶體抑制劑(硼替佐米)[7]，尤其是鉑類藥物引起的CIPN,其發(fā)生率可高達81.5%～98%。有研究顯示，CIPN主要表現(xiàn)為患者四肢對稱部位的麻木、刺痛、觸覺減退或異常感，嚴重時可出現(xiàn)腱反射消失、運動失調(diào)[8]，同時更容易出現(xiàn)殘疾和跌倒[9]。然而目前尚未有明確有效的方法來防治CIPN的發(fā)生和發(fā)展[10]。

SCs是周圍神經(jīng)的主要神經(jīng)膠質(zhì)細胞，它們通過形成髓鞘來維持周圍神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性，為神經(jīng)元提供支持和營養(yǎng)，調(diào)節(jié)神經(jīng)元微環(huán)境的平衡。神經(jīng)損傷后，SCs被刺激去分化和增殖，然后遷移到損傷區(qū)清除髓鞘碎片恢復(fù)神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)。在周圍神經(jīng)的再生及神經(jīng)損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。因此，促進SCs的增殖會加速軸突的生長和周圍神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)。

RHO激酶是一種蛋白激酶，包括肌球蛋白輕鏈和肌球蛋白輕鏈磷酸酶參與RHO/ROCK信號通路，磷酸化的下游目標，調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架組織和內(nèi)皮屏障功能[11]。RHO/ROCK信號通路還參與細胞黏附、遷移、增殖、細胞因子激活、炎癥細胞遷移、平滑肌細胞收縮和細胞周期調(diào)節(jié)。最近的幾項研究表明，抑制RHO/ROCK通路可以產(chǎn)生多種作用，包括抗腫瘤[12-13]、抗炎、抗凋亡和抗氧化作用[14-15]。

BAX、Caspase3作為促凋亡蛋白，其表達升高可促進細胞凋亡。TOM70是線粒體外膜轉(zhuǎn)運蛋白中的一種,在維持線粒體正常形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的中起著重要作用[16-18]。研究發(fā)現(xiàn)，TOM70缺失會損傷心肌細胞的線粒體完整性，促進ROS產(chǎn)生，最終加重細胞損傷[19]。OPA1是線粒體內(nèi)膜的主要融合蛋白，而DRP1則參與線粒體分裂的調(diào)控，這種融合-分裂的平衡被破壞將導(dǎo)致線粒體片段化并出現(xiàn)功能性的障礙，表現(xiàn)為ATP合成減少，ROS產(chǎn)生增多等，進而促進細胞凋亡及疾病的發(fā)展[20]。

本次研究表明奧沙利鉑通過上調(diào)DRP1蛋白表達，下調(diào)OPA1、TOM70蛋白表達誘導(dǎo)SCs線粒體結(jié)構(gòu)、功能紊亂，同時通過上調(diào)Bax、Caspase3蛋白表達，下調(diào)Bcl2蛋白表達促進細胞凋亡導(dǎo)致SCs損傷，而RHO/RACK通路抑制劑可顯著逆轉(zhuǎn)上述變化，保護SCs線粒體功能及結(jié)構(gòu)完整性，抑制細胞凋亡，從而起到保護作用。