程燕妮，劉 佳，袁 野，張德太， 王 琳

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院 a.檢驗科；b.再生醫(yī)學中心；c.胃腸外科， 湖北 武漢 430022)

有氧糖酵解是腫瘤細胞的重要特征之一。在有氧條件下，正常細胞通常以有氧呼吸的方式消耗葡萄糖。然而，腫瘤細胞仍然進行活躍的糖酵解，這種代謝特征被稱為Warburg效應[1]。腫瘤細胞的有氧糖酵解與其多種生物功能密切相關，越來越多的研究者開始從異常代謝的角度探索腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉移的分子機制。

多篇文獻報道[2-4]，丙酮酸激酶M2型(PKM2)高表達于乳腺癌、胃癌等多種癌癥患者的腫瘤組織、血液以及分泌物中，其表達水平與患者的臨床表現(xiàn)密切相關，能夠用于對患者病情及預后進行評估，具有臨床檢測價值。隨著對PKM2研究的深入，PKM2在腫瘤組織中的作用越來越受到重視。探討PKM2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制還能夠為腫瘤的臨床治療提供新的思路。本文基于PKM2在各系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生機制及臨床篩查、診斷和治療中的價值，以及臨床檢測方法進行了綜述。

1 PKM2的生物學特性

丙酮酸激酶是糖酵解過程的重要限速酶之一，主要作用是將磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和二磷酸腺苷(ADP)轉變成丙酮酸，并釋放大量三磷酸腺苷(ATP)，在糖酵解過程中起到關鍵作用。丙酮酸激酶有4種同工酶，分別在特定的組織或細胞中表達。其中，PKM2與腫瘤細胞的Warburg效應密切相關，在腫瘤異常代謝中扮演重要角色。

PKM2最初高度表達于快速增殖的胎兒組織和干細胞中，與組織修復和再生密切相關，并在胚胎發(fā)育成熟的過程中逐漸消失。然而，PKM2在腫瘤發(fā)生過程中再次出現(xiàn)。PKM2在腫瘤細胞的糖代謝中起到限速酶的作用，并通過參與有氧糖酵解積累糖酵解中間產物，為腫瘤細胞提供快速增殖的原料，促進腫瘤的形成、侵襲及轉移[1, 5]。此外，PKM2還能夠與其他糖代謝關鍵酶一同調節(jié)腫瘤細胞的能量代謝及線粒體重編程[6]。

2 PKM2與各系統(tǒng)腫瘤的關系

2.1頭頸部腫瘤 頭頸部惡性腫瘤是我國常見的惡性腫瘤之一，其中超過90%為鱗狀細胞癌。PKM2在舌[7]、口腔鱗狀細胞癌[8]及人膠質母細胞瘤中均高度表達，與不良臨床病理學特征顯著相關。在口腔鱗狀細胞癌中，PKM2可通過調節(jié)癌細胞中活性氧的產生和谷氨酰胺與乳酸之間的整合，調控細胞能量代謝，促進腫瘤的生長、侵襲[8]。PKM2還可調節(jié)人膠質母細胞瘤的細胞周期進程和細胞生長，影響細胞侵襲和克隆形成能力[9]。以上研究表明，PKM2在頭頸部腫瘤中發(fā)揮著致瘤和促瘤作用，可能是潛在的預測指標和治療靶點。

2.2胸部腫瘤 在全球范圍內，肺癌是發(fā)病率及死亡率最高的一類惡性腫瘤，臨床上的主要亞型為非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC)，其中40%以上為肺腺癌[10]。絕大多數(shù)NSCLC患者在確診已經(jīng)發(fā)生轉移，放療和化療效果差，亟需尋找肺癌的早期診斷標志物及治療靶標。PKM2在肺腺癌患者的原發(fā)及轉移灶組織中的表達水平顯著上調，與腫瘤細胞的分化程度及惡性程度密切相關[11]。Guo等[12]對173例原發(fā)肺腺癌組織樣本進行免疫組化染色，結果顯示，PKM2與患者的TNM(tumor node metastasis classification)分期密切相關(P=0.005)，PKM2高表達患者的總生存期(overall survival，OS)(P<0.01)和無病生存率(disease free survival，DFS)(P=0.050)顯著短于低表達患者。敲低肺癌細胞中PKM2的表達能夠顯著降低細胞的葡萄糖攝取能力，明顯抑制細胞增殖和侵襲[11]。同時，調控PKM2還可對細胞的放療[13]和化療[14]敏感度產生顯著的影響，為NSCLC的治療提供了新思路。

PKM2在乳腺癌及食管癌組織中表達升高，與在肺癌中的作用相似，監(jiān)測和靶向PKM2有助于預測患者的化療反應和逆轉腫瘤細胞的化療耐藥。在乳腺癌中，PKM2表達與腫瘤大小呈負相關(P=0.008)，與淋巴結分期呈正相關(P=0.047)，PKM2高表達預示著較差的無進展生存(progression-free survival，PFS)和OS[2]。抑制耐藥性乳腺癌細胞內PKM2表達可顯著增強細胞對多柔比星及5-氟尿嘧啶等化療藥物的敏感度[2, 15]。在食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)中，PKM2表達與患者的化療敏感度呈顯著的負相關(P=0.0342) ，下調PKM2有利于增強順鉑化療效果[16]。雙氫青蒿素等藥物也可以通過下調PKM2對ESCC起到治療作用[17]。

2.3腹腔腫瘤 目前，胃鏡和病理活檢是最常用的胃癌早期診斷方法，檢測費用高，取樣過程繁瑣、侵入性強，限制了胃癌的大規(guī)模篩查和早期診斷。尋找有意義的生物標志物可為篩查胃癌高危人群和早診斷早治療提供重要參考。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中的PKM2表達水平自胃癌早期階段就明顯增高[3]，與淋巴結轉移(P=0.049)、腫瘤侵襲(P=0.007)和TNM分期(P=0.001)呈正相關[4]。胃癌細胞中PKM2表達的下調能夠明顯抑制細胞增殖和遷移[4]，可能是胃癌患者的潛在治療靶點。

據(jù)統(tǒng)計，2020年結直腸癌成為全球新發(fā)病例第三位的腫瘤。由于結直腸癌發(fā)病早期無明顯癥狀，發(fā)展相對緩慢，早期容易被忽視。隨著對結直腸癌發(fā)病機制的進一步探索， PKM2成為研究的焦點。結直腸癌組織中，PKM2表達顯著增加，且其表達水平與腫瘤浸潤深度和臨床分期密切相關[18]。PKM2基因沉默能夠阻礙細胞增殖和細胞周期，并抑制細胞的克隆形成及遷移能力[18]，重新建立結直腸癌細胞對奧沙利鉑(一線化療藥物)的敏感度[19]。目前已發(fā)現(xiàn)丁酸、單寧酸等多種藥物可以通過抑制PKM2的活性和表達來阻斷糖酵解，并進一步抑制結直腸癌細胞增殖和結直腸癌進展[20-21]。因此，PKM2可作為結直腸癌治療的靶標，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，對結直腸癌患者治療方式的選擇有指導性意義。

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占原發(fā)性肝癌的絕大部分，主要通過手術切除和肝移植達到治愈的目的。Li等[22]對GEPIA數(shù)據(jù)庫進行分析發(fā)現(xiàn)，PKM2在HCC組織中的表達水平明顯高于相鄰的正常組織，PKM2高表達患者通常腫瘤較大(P=0.013)、分期較晚(P=0.035)，OS和DFS也明顯縮短。PKM2高表達的HCC細胞系通常具有更強的轉移潛能[22]，下調PKM2的表達量可直接抑制腫瘤的生長并誘導細胞周期停止和凋亡[23]。此外，原花青素B2和辛伐他汀等藥物可以通過下調腫瘤內PKM2表達，有效增強患者對索拉菲尼(晚期一線化療藥物)的敏感度，提高晚期患者的生存率[23-24]。

PKM2在大多數(shù)膽囊癌和胰腺癌組織和細胞系中高度表達，可以作為獨立的預后因素，協(xié)助臨床更為全面的判斷病情、指導治療。在膽囊癌早期，PKM2即具有出色的預測價值，在組織中的表達水平隨疾病進展逐漸增加，與膽囊癌患者的淋巴結轉移、晚期TNM分期和較差的OS、短期復發(fā)顯著相關，可用于區(qū)分高危人群[25]。在胰腺導管腺癌中，PKM2可以與M2型巨噬細胞共同促進腫瘤進展，其表達水平與TNM分期(P=0.0002)和血管侵犯(P=0.012)呈正相關性[26]。PKM2還可作為胰腺導管腺癌的治療靶點，明顯抑制細胞的增殖、遷移[27]。上述研究證實，PKM2在腹腔腫瘤的診斷和治療方面具有較為廣泛的作用。

2.4泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤 在女性惡性腫瘤中，宮頸癌的發(fā)生率僅次于乳腺癌。目前，臨床主要根據(jù)宮頸癌患者的FIGO分期決定治療方案和評估生存預后。FIGO分期主要依賴于婦科檢查及活體組織檢查，對判斷宮旁浸潤的主觀性及不確定性導致分期偏倚，直接導致治療方案存在偏差。因此，尋找有效篩查指標，對患者采取相應分層干預治療非常重要。研究發(fā)現(xiàn)，PKM2在宮頸癌患者(尤其HPV陽性患者)的腫瘤組織中轉錄水平明顯增高，其表達水平增加與患者的OS率降低密切相關，具有一定的預后價值[25]。較PKM2低表達患者，PKM2高表達患者對順鉑的化療敏感度更高，而放射敏感度較弱。監(jiān)測和靶向PKM2有助于預測和調控宮頸癌患者對順鉑化療及放射治療的敏感度[26-27]，彌補FIGO分期的不足。

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其中絕大多數(shù)為膀胱尿路上皮癌。研究證實，PKM2在膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用[28]。Huang等[29]對215例膀胱尿路上皮癌患者的腫瘤樣本進行檢測發(fā)現(xiàn)， PKM2在腫瘤組織中過度表達，其中高級別侵入性腫瘤組織尤為明顯。PKM2可用于對膀胱癌患者的病情估計和預后判斷，其表達水平與腫瘤分級、分期和淋巴結狀態(tài)顯著相關，PKM2低表達患者的OS和DFS均高于高表達者(P<0.01)，死亡風險也更低。膀胱癌細胞中PKM2的下調將抑制細胞增殖，誘導細胞發(fā)生凋亡、自噬[30]。同時，順鉑耐藥性膀胱癌細胞在經(jīng)過紫草素、PKM2-shRNA等藥物處理后，細胞內PKM2的表達水平下調，順鉑敏感度增加[31-32]。以上研究表明，PKM2相關研究對膀胱癌的診療具有實際意義。

腎細胞癌 (renal cell carcinoma, RCC) 是成人腎癌的主要類型，易發(fā)生復發(fā)和轉移，患者的臨床結果較差。目前，RCC被認為是一種代謝疾病，因此探索PKM2在其發(fā)生發(fā)展中的作用可能為RCC提供潛在的治療策略?，F(xiàn)有的研究表明，PKM2在RCC組織及細胞中過度表達，抑制其表達可以有效降低腫瘤細胞活力，并可誘導自噬的發(fā)生[33]。PKM2與RCC的關系尚待進一步研究去探明。

2.5血液系統(tǒng)腫瘤 白血病和多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是最常見的兩種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，分別以造血干細胞或骨髓單克隆漿細胞的惡性克隆為主要特征。PKM2在白血病患者的骨髓細胞及血液中過度表達，調控細胞增殖及分化，并介導幾種白血病亞型耐藥性(如視黃酸耐藥的急性早幼粒細胞白血病細胞)的產生[34]。較PKM2低表達患者，高表達患者的無事件生存率(event free survival ，EFS)及OS顯著降低[35]。雙氫青蒿素可以通過干擾PKM2的表達抑制白血病細胞增殖，促進細胞分化、凋亡，有效地阻止白血病進展[36]。在MM細胞中敲低PKM2的表達，也有助于抑制MM細胞的增殖和黏附，進而抑制由黏附導致的耐藥性[37]。因此， PKM2可能是治療血液系統(tǒng)腫瘤的潛在靶標。

2.6皮膚及骨腫瘤 皮膚惡性黑色素瘤及骨肉瘤具有惡性程度高、預后差等特點，中晚期患者腫瘤易復發(fā)、轉移，療效較差。目前早期篩查指標的相關研究很少，亟需尋找合適的生物標志物。PKM2在黑色素瘤早期階段的表達水平即明顯增加，在骨肉瘤組織中也表達上調，且其表達水平與黑色素瘤及骨肉瘤患者的臨床分期、轉移和分化情況，以及預后等密切相關[38-39]。通過與病理結果結合，PKM2可用于評估患者的病情及預后。

3 PKM2的臨床檢測

3.1方法學 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)是目前醫(yī)院常用的檢測方法之一，利用抗原抗體之間的特異度免疫反應對蛋白進行定性和定量檢測。ELISA是一種敏感度高、特異度強、重復性好的實驗診斷方法，可用于血液[40-41]、尿液[42]、糞便[43]及宮頸陰道分泌物[44]等多種標本中PKM2的測定。

由于PKM2是一種催化酶，因此酶活性測定法對PKM2的定量更有意義。丙酮酸激酶多為四聚體，對 PEP 具有高親和力，催化活性較高； PKM2則一般為二聚體，對PEP親和力低，在變構激活劑果糖1, 6-二磷酸(FBP)激活下可形成四聚體。Guan等[45]運用PKM2的這種特性，設計了乳酸脫氫酶-NADH偶聯(lián)測定法，使用特異度識別 PKM2 二聚體的單克隆抗體對PKM2進行間接測量。血清PKM2經(jīng)酶動力學測定法測定對乳腺癌診斷的敏感度為81.0%，特異度為70.0%，與ELISA之間存在很強的相關性(相關系數(shù)為0.977)，且準確度相對高于ELISA。

電化學發(fā)光免疫分析結合了免疫分析技術和電化學發(fā)光反應，通過檢測待測物質與發(fā)光體標記抗原(抗體)特異度結合后發(fā)出的光信號，確定待測物質的含量。與ELISA相比，電化學發(fā)光法靈敏度極高，所需血漿體積僅需其他免疫測定方法的50%，測定時間也大幅縮短。Croner等[46]基于電化學發(fā)光法對受試者血漿樣本進行檢測，確立了包括PKM2在內的一組預測因子(敏感度為80%，特異度為83%)，可用于篩查具有結直腸癌高風險的患者。

對于腫瘤活檢組織中的PKM2，常使用免疫組化法進行檢測，協(xié)助對患者的腫瘤分型分期及預后評估，并對患者的治療方案提出建議。除上述常用方法外，在未經(jīng)活檢的情況下，還可通過生物成像的方式對PKM2進行檢測。Wang等[47]通過將PKM2激活劑TEPP-46 與熒光團香豆素結合，設計了一種PKM2 特異度生物探針，可誘導PKM2形成四聚體并發(fā)出熒光，通過生物成像高靈敏度檢測PKM2。Beinat等[48]則將TEPP-46與PET示蹤劑18F DASA-23結合，設計了放射性探針18F DASA-23，通過PET成像的方法判斷前列腺癌組織內PKM2的水平，評估腫瘤進展。

3.2臨床意義 目前臨床上惡性腫瘤早期診斷和篩查多采用血液檢測，具有簡便快捷、微創(chuàng)性、經(jīng)濟適用等多種優(yōu)點。血液PKM2與CA19-9、CEA等傳統(tǒng)腫瘤標志物聯(lián)合使用可以有效提高癌癥的診斷特異度、敏感度和準確度[40-41]。通過ELISA法檢測的血清PKM2對結直腸癌診斷的特異度可達95%，同時還能夠區(qū)分早期疾病(靈敏度48%)[49]。在用于宮頸癌篩查時，血清PKM2的靈敏度為82%，其表達與宮頸癌患者臨床特征(腫瘤直徑、TMN分期等)以及病情進展具有顯著正相關性[50-51]。此外，血漿PKM2水平同樣具有一定的臨床診斷價值。蘇鵬等[52]研究證實，血漿PKM2可用于反映NSCLC患者疾病狀態(tài)及預測復發(fā)。對NSCLC手術及術后復發(fā)患者的血液進行檢測發(fā)現(xiàn)，血漿PKM2水平在術前較高，術后恢復至正常，患者復發(fā)時重新升高。

糞便隱血試驗(fecal occult blood test, FOBT)常作為消化道惡性腫瘤的過篩試驗在臨床上使用。但在實際應用中，F(xiàn)OBT的干擾因素(方法、取材等)較多，準確度和敏感度均不高。糞便PKM2的測定可能是一種有價值的結直腸癌篩查新工具，靈敏度和特異度分別可達73%和78%[43]。在用于結直腸癌的篩查時，免疫化學FOBT特異度和陽性預測值較好(0.89和0.53)，PKM2的敏感度和陰性預測值較高(0.87和0.96)，糞便PKM2檢測與FOBT的聯(lián)合使用有助于預測結直腸癌發(fā)生風險[53]。

近年來，尿液檢驗逐漸被應用于腫瘤發(fā)病機制研究和生物標志物篩選等方面，應用范圍日趨擴大。在基于尿液的測試中，最常用于診斷和監(jiān)測膀胱癌的方法是細胞學檢查。然而，細胞學檢查的敏感度僅為約35%，漏診比例較高[54]。研究者發(fā)現(xiàn)，與正常受試者相比，膀胱癌患者尿液中PKM2水平顯著增高，特異度為100%，敏感度可達82%。通過檢測尿液PKM2水平可以為臨床醫(yī)生提供快速、有價值的檢測，輔助細胞學檢查對疑似患有膀胱癌的患者進行篩查[42]。

陰道和宮頸分泌物主要由子宮內膜和宮頸腺體產生。在子宮內膜或宮頸發(fā)生病變時，病變細胞表面脫落的一些可溶性蛋白成分可能直接進入分泌液中。因此，宮頸、陰道分泌物可用于檢測某些腫瘤標志物。蔡尚霞等[44]對156例子宮內膜病變患者的宮頸及陰道分泌物中的PKM2進行檢測發(fā)現(xiàn)，與正常受試者相比，患者分泌物中PKM2水平明顯增加，與血清PKM2的聯(lián)合使用可用于區(qū)分子宮頸及子宮內膜的增生和癌變，有利于早期篩查和診斷。

4 小結與展望

PKM2過表達于頭頸部、胸部、腹腔等多部位腫瘤組織中，在腫瘤細胞的增殖分化、侵襲和遷移中發(fā)揮重要的作用，與患者較差的臨床表現(xiàn)和不良預后密切相關。臨床上對病變組織的活檢標本進行PKM2檢測，有助于進一步明確診斷、指導分期分型及治療方案、評估預后等。利用ELISA等常規(guī)實驗技術對體液和糞便等標本中PKM2的存在及水平進行檢測，對結直腸癌、NSCLC、宮頸癌等癌癥診斷的敏感度和特異度不遜于傳統(tǒng)腫瘤標志物，有利于腫瘤的篩查、診斷和術后監(jiān)測等，是一種潛在的腫瘤檢測手段。此外，PKM2也可作為腫瘤的治療靶點，通過抑制腫瘤的增殖及侵襲能力或調控患者對放療、化療的敏感度誘導腫瘤細胞的死亡。