板栗組織培養(yǎng)及褐變研究

□文/李婧實(shí) 周麗艷 睢金凱 程曉園

板栗原產(chǎn)地是在中國(guó)，是世界上非常受歡迎的干果之一。板栗果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特。常見(jiàn)的板栗產(chǎn)品有烤板栗、速凍板栗粒、板栗罐頭、板栗汁、板栗飲料等，深受市場(chǎng)消費(fèi)者的喜愛(ài)。

一、板栗的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值

板栗富含人體所需的營(yíng)養(yǎng)素和微量元素。新鮮板栗果實(shí)的碳水化合物含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他同類(lèi)產(chǎn)品，因此可以替代基本食物，為人體提供熱量。栗子也富含蛋白質(zhì)。板栗和板栗皮的脂肪含量普遍，但大部分為不飽和脂肪酸。板栗中的微量元素含量也高于普通水果，尤其是鐵、鋅和鉀。板栗具有很高的藥用價(jià)值。板栗中所含的微量元素對(duì)預(yù)防骨質(zhì)疏松有很好的作用。不飽和脂肪酸在對(duì)血脂進(jìn)行調(diào)節(jié)、減少血栓形成、預(yù)防心血管疾病方面發(fā)揮著積極作用。根據(jù)中醫(yī)的食物同源理論，常吃栗子可以強(qiáng)筋健腎，其效果與人參、當(dāng)歸相當(dāng)［1］。

二、板栗組織培養(yǎng)

近年來(lái)，板栗品種的選育也有了極大的改善，優(yōu)良栗子的供應(yīng)迫在眉睫。通過(guò)運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)能夠有效地解決這些技術(shù)問(wèn)題，但其效果還有一定的不足。以燕山低日紅板栗種子為例，誘導(dǎo)異種分枝，生根率為53.7%，進(jìn)行體外覆蓋。目前，還沒(méi)有直接利用莖尖、腋芽、樹(shù)干和葉片等營(yíng)養(yǎng)器官作為解釋性再生系統(tǒng)，進(jìn)行板栗的扦插以及組織培養(yǎng)時(shí)，生根比較困難，其根源尚不清楚。一些人認(rèn)為栗子幼苗或小枝中的過(guò)量現(xiàn)象是導(dǎo)致抑制根系生長(zhǎng)緩慢的重要原因，但還缺少一定的數(shù)據(jù)支持［2］。與其他果樹(shù)進(jìn)行對(duì)比，板栗組織培養(yǎng)的研究相對(duì)落后，這也讓板栗基因工程的研究存在很大的困難。美國(guó)、歐洲、日本等國(guó)運(yùn)用板栗的腋生繁殖，進(jìn)行無(wú)根播種，能夠有效地降低發(fā)病率。我國(guó)對(duì)板栗栽培技術(shù)的研究較少。以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，板栗再生系統(tǒng)中的形態(tài)發(fā)生結(jié)合是限制板栗組織培養(yǎng)快速增殖的主要因素。組織無(wú)法區(qū)分外來(lái)分枝，增殖的無(wú)根幼苗生根的困難性比較大，同時(shí)在體細(xì)胞胚發(fā)育的過(guò)程中，很難區(qū)分細(xì)胞極性。因此，為了能夠促進(jìn)板栗形成快速繁殖體系以及再生體系，不僅需要對(duì)板栗離體培養(yǎng)的技術(shù)進(jìn)行研究，還需要不斷的探索板栗離體生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制，更好的推動(dòng)板栗離體生長(zhǎng)，有效提升板栗的組織培養(yǎng)水平［3］。

三、板栗組織培養(yǎng)中的褐變問(wèn)題

在板栗組織培養(yǎng)中，褐變會(huì)引起外植體的反分化或再分化，從外植體表面釋放棕色物質(zhì)到培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基逐漸變褐，外植體進(jìn)一步褐變死亡。外植體通常是指從板栗切下的組織或切片，用于創(chuàng)建、生長(zhǎng)或進(jìn)行克隆板栗的組織培養(yǎng)。當(dāng)傳代培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)的組織片段在轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基時(shí)被稱(chēng)為外植體。褐變?cè)诎謇踅M織培養(yǎng)過(guò)程中是經(jīng)常會(huì)發(fā)生的情況，褐變、真菌污染和水分過(guò)多（即玻璃化）被認(rèn)為是板栗組織培養(yǎng)中的三大問(wèn)題。因?yàn)榭刂坪肿儽瓤刂莆廴竞退诌^(guò)剩更難，有效控制褐變也是進(jìn)行板栗組織培養(yǎng)成功的秘訣。褐變一般是在外植體中出現(xiàn)，常發(fā)生在板栗愈傷組織傳代、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)以及原生質(zhì)體分離培養(yǎng)的過(guò)程中，褐變會(huì)對(duì)外植體、細(xì)胞、培養(yǎng)基以及多種酶、培養(yǎng)物的生長(zhǎng)和分化有抑制作用，甚至死亡。

四、板栗組織培養(yǎng)發(fā)生褐變的原因

褐變主要可以劃分為酶促褐變以及非酶促褐變，在板栗組織培養(yǎng)中，褐變主要是由酶的引起。酶促褐變需要滿(mǎn)足三個(gè)條件：酶、基質(zhì)和氧。引起褐變的酶主要有多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）和苯胺氨酶（PAL），其中比較重要的是PPO酶，也是引起褐變的主要因素。引起褐變的酶基質(zhì)主要由酚組成，在正常發(fā)育的植物組織中，基質(zhì)、氧和PPO的存在不會(huì)引起褐變。這是因?yàn)樵谄胀ńM織細(xì)胞中，多酚在細(xì)胞液泡中很常見(jiàn)，PPO在每個(gè)細(xì)胞中都很常見(jiàn)。在種子或細(xì)胞組織中，由于這樣的區(qū)域分布，PPO不能進(jìn)入基質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和破壞時(shí)，創(chuàng)造酶和PPO接觸的條件，在有氧的情況下，酚被氧化為醌，發(fā)生了一系列脫水和聚合物反應(yīng)。最終形成了一種深棕色物質(zhì)，發(fā)生了褐變現(xiàn)象。

五、克服板栗褐變的措施

1.選擇合適的板栗培養(yǎng)條件

對(duì)外植體進(jìn)行合理的選擇，構(gòu)建最佳的培養(yǎng)環(huán)境，也是阻止板栗發(fā)生褐變的重要方式。外植體的褐變程度隨時(shí)間和年齡的不同而不同，成年的樹(shù)木褐變程度較苗木嚴(yán)重，夏季材料褐變程度較冬、早春、秋季嚴(yán)重。介質(zhì)的選擇性也必須適當(dāng)，注意介質(zhì)的狀態(tài)類(lèi)型，培養(yǎng)基的組成，如礦物鹽、蔗糖濃度、激素水平和組合也應(yīng)適當(dāng)。

2.添加褐變抑制劑和吸附劑

在組織制備過(guò)程中，通常在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑和吸附劑，以對(duì)抗酶對(duì)外植體的影響。在培養(yǎng)基中通過(guò)添加抗氧化劑，能夠改變外植體周?chē)沫h(huán)境，組織酚氧化，有效的減少褐變?，F(xiàn)階段，在組織培養(yǎng)中通過(guò)能夠使用的抗氧化劑種類(lèi)比較多，需要進(jìn)行合理的選擇。

3.其他褐變預(yù)防措施

褐變外植體材料的連續(xù)轉(zhuǎn)移和預(yù)處理可以降低醌類(lèi)對(duì)培養(yǎng)物的毒性作用。接種1～2天后，芽尖長(zhǎng)出，將組織轉(zhuǎn)入到新培養(yǎng)基。接種12～24小時(shí)后，需要轉(zhuǎn)移到液體的培養(yǎng)基中，每天接種一次，持續(xù)1周以抑制褐變。外植體用流水沖洗干凈后，放入5℃左右的冰箱中，低溫處理12～24小時(shí)，進(jìn)行滅菌，然后，先將外植體放置到含蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)7天，從培養(yǎng)基中取出外植體，使外植體中的酚類(lèi)物質(zhì)部分浸潤(rùn)，浸入0.1%的漂白粉溶液10分鐘，再接種到合適的培養(yǎng)基中，有效防治褐變［4］。

結(jié)語(yǔ)：

板栗分布在世界各地，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。為了充分利用板栗資源的效益，探索板栗的種植優(yōu)化，已成為板栗資源保護(hù)、開(kāi)發(fā)以及可持續(xù)利用的重要研究方向。