●沈 雙 高 明

（1.宿遷市宿豫區(qū)大興鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)服務(wù)站 江蘇 宿遷 223801；2.江蘇省宿遷市宿豫區(qū)侍嶺鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)服務(wù)站 江蘇 宿遷 223800）

禽流感是由甲型流感病毒（Avian Influenza virus，AIV）引起的一種急性、呼吸道傳染病，主要在禽類、鳥類動物中流行。疫苗是目前防控AIV的有效方法，禽流感疫苗自20世紀(jì)40年代開始研制，目前市場上禽流感疫苗多種多樣，主要包括基因工程疫苗、減毒疫苗、滅活疫苗以及病毒樣顆粒疫苗。其中基因工程疫苗又可分為核酸疫苗、重組活載體疫苗和亞單位疫苗，大大降低了禽流感的感染率和發(fā)病率。

1 疫苗生產(chǎn)工藝

1.1 雞胚為基質(zhì)的疫苗工藝

20世紀(jì)30年代建立了以雞胚為基質(zhì)的疫苗生產(chǎn)工藝，目前仍是流感疫苗生產(chǎn)應(yīng)用最廣泛的方法。該工藝生產(chǎn)出來的疫苗具有病毒產(chǎn)量高、安全性高、免疫性好、保護(hù)率高等優(yōu)勢，且生產(chǎn)成本低廉，制備流程簡單。雞胚為基質(zhì)的流感疫苗制備工藝流程：雞胚尿囊液滅活→離心過濾→超濾→密度梯度離心→分子篩/超濾脫糖→裂解后過濾→超濾除去裂解劑、配制除菌單價原液→配制半成品→成品[1]。但這種傳統(tǒng)的疫苗生產(chǎn)過程中需要大量的SPF雞胚，并且生產(chǎn)過程中存在所需設(shè)備復(fù)雜、雞胚孵育時間長、產(chǎn)量低、工序繁瑣、難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化等問題，難以滿足養(yǎng)禽業(yè)規(guī)?；?、集約化發(fā)展對疫苗生產(chǎn)的高需求。

1.2 以細(xì)胞為基質(zhì)的疫苗工藝

隨著市場需求的增大以及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展，細(xì)胞作為疫苗生產(chǎn)基質(zhì)的優(yōu)勢逐漸凸顯，目前用于生產(chǎn)禽流感疫苗的細(xì)胞主要有MDCK細(xì)胞、Vero細(xì)胞以及昆蟲桿狀細(xì)胞。以細(xì)胞為基質(zhì)制備流感疫苗的流程：傳代細(xì)胞→加入胰酶及流感病毒感染→病毒增殖高峰期收獲→離心澄清→超濾→層析純化→裂解后過濾→超濾除裂解劑→配制除菌單價原液→A1/A3/B（/ B）配制半成品→成品。與傳統(tǒng)的雞胚生產(chǎn)工藝相比，細(xì)胞生產(chǎn)具有工序簡單、污染小、可操作性強(qiáng)、工業(yè)化水平高等優(yōu)勢，能夠?qū)崿F(xiàn)AIV的高效復(fù)制和大規(guī)模生產(chǎn)，可有效應(yīng)對禽流感大規(guī)模流行時雞胚疫苗供應(yīng)不足的難題。

2 常見禽流感疫苗及其優(yōu)缺點

2.1 DNA疫苗

DNA疫苗又被稱為核酸疫苗，是一種新型基因工程疫苗，該種疫苗是將含AIV的保護(hù)性抗原序列克隆到真核表達(dá)載體中，之后將重組后的質(zhì)粒經(jīng)細(xì)菌增殖后提取純化，再導(dǎo)入動物細(xì)胞。在這個過程中，重組質(zhì)粒中的啟動子啟動轉(zhuǎn)錄過程，然后核糖體進(jìn)行翻譯，合成外源性抗原蛋白。一部分外源蛋白與MHC-I類分子結(jié)合，在細(xì)胞表面激活CD8+T細(xì)胞，使其分化為記憶T細(xì)胞和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫；另一部分外源蛋白則在溶酶體中水解為多肽后與MHCⅡ類分子結(jié)合，在細(xì)胞膜表面和CD4+T細(xì)胞反應(yīng)；此外，還有一部分被分解成抗原多肽后與B細(xì)胞結(jié)合，活化B細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗體，誘導(dǎo)體液免疫。綜上所述，DNA疫苗通常注射1次就可以產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，且具有免疫效果持久、制備流程簡單、易大批量生產(chǎn)、安全性高、儲存運(yùn)輸方便、成本低等優(yōu)點。但也存在免疫效率低、表達(dá)效率低等問題。此外，構(gòu)建過程中所用載體多攜帶抗生素基因，故容易誘導(dǎo)機(jī)體對相應(yīng)的抗生素產(chǎn)生抗體，為細(xì)菌性疾病的防控埋下隱患。

2.2 重組活載體疫苗

基因工程重組活載體疫苗，在減毒活疫苗的基礎(chǔ)之上，以活病毒為載體，利用反向遺傳操作技術(shù)，對病毒基因組加以修飾，構(gòu)建含AIV保護(hù)性抗原基因的重組病毒。其中以痘病毒為載體的禽痘疫苗市場占有率最高，但是隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)新城疫病毒、火雞皰疹病毒、禽腺病毒等也可作為載體用以制備疫苗?；蚬こ讨亟M活載體疫苗兼有滅活疫苗的優(yōu)點，又具有使用方便、安全可靠、“一針多防”的優(yōu)勢。

2.3 基因工程亞單位疫苗

基因工程亞單位疫苗是指將AIV中具有保護(hù)性的亞單位抗原成分，血凝素蛋白（HA）和神經(jīng)氨酸酶蛋白（NA），通過真核或原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化后，輔以佐劑制備而成，且佐劑能夠顯著增強(qiáng)疫苗的免疫原性。但是該種疫苗存在誘導(dǎo)的免疫保護(hù)維持時間短、制作成本高等缺陷。

2.4 減毒活疫苗

減毒活疫苗主要通過鼻內(nèi)接種，感染途徑類似于病毒的自然感染，一次免疫即可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液、細(xì)胞和黏膜免疫應(yīng)答，能夠提供良好、持久的交叉免疫保護(hù)。減毒活疫苗穩(wěn)定性好，還可以通過氣溶膠或者飲水的方式進(jìn)行免疫，且免疫原性高。但是由于AIV易于變異，因此要避免因使用減毒活疫苗帶來“毒力返祖”的情況。

2.5 滅活疫苗

滅活疫苗種類多樣，主要包含異源全病毒滅活疫苗、同源全病毒滅活疫苗以及重組禽流感滅活疫苗。其中，前兩種疫苗是以當(dāng)?shù)亓餍卸局昊蛘呤澜缧l(wèi)生組織預(yù)測的流行株作為疫苗候選株；而重組禽流感滅活疫苗則是利用反向遺傳技術(shù)克隆出AIV不同片段的cDNA序列，構(gòu)建在真核表達(dá)質(zhì)粒上，然后在雞胚中進(jìn)行病毒拯救，無菌收取尿囊液后進(jìn)行純化和濃縮；最后病毒經(jīng)甲醛或β-丙內(nèi)酯滅活后，輔以佐劑制成油乳劑疫苗。不同于減毒活疫苗等其他疫苗，滅活疫苗具有安全性高、穩(wěn)定性好、便于儲備運(yùn)輸、制備周期短、針對流行株保護(hù)效率高的特點。但是滅活疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫水平有限，維持時間短，通常需要注射2次以上才能夠產(chǎn)生較高的抗體滴度，而且誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體具有病毒株亞型特異性，對變異產(chǎn)生的新病毒無中和作用。

2.6 病毒顆粒樣疫苗

病毒顆粒樣疫苗（VLPs）又被稱為“假病毒”，這類疫苗通常含有一個或多個AIV結(jié)構(gòu)蛋白，不含病毒遺傳物質(zhì)，由表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞自行組裝而成，是一種在形態(tài)上類似于病毒的蛋白顆粒。市場上現(xiàn)有的禽流感疫苗通常利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)單獨的HA或者HA和M1蛋白的抗原基因。因VLPs不含核酸，故可以有效避免其他病毒感染，安全性較高，同時還可以有效刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，適于大規(guī)模生產(chǎn)。

3 總結(jié)

目前疫苗接種仍是防控AIV的首選方法。盡管流感疫苗研制已經(jīng)取得了巨大進(jìn)步，但由于AIV變異快，特別是季節(jié)性流感病毒的持續(xù)抗原漂移，致使疫苗與流行毒株匹配性較差，嚴(yán)重影響了疫苗的效力，給AIV的防控帶來挑戰(zhàn)。積極研發(fā)安全、高效、低成本的新型禽流感疫苗，仍是預(yù)防禽流感的重要任務(wù)。因此，需要加大對廣譜抗病毒疫苗的研發(fā)，以抵御不同亞型AIV毒株的感染，從源頭防控預(yù)防禽流感大流行的發(fā)生，并且加強(qiáng)標(biāo)記疫苗的研發(fā)，以滿足撲滅和凈化AIV的技術(shù)需求。此外，還應(yīng)該做好接種疫苗后對免疫效果的監(jiān)測工作，建立免疫檔案，若存在漏免或抗體水平較低的情況，應(yīng)及時補(bǔ)免，提高免疫密度，群防群控。