自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎的分子診斷研究進(jìn)展

吳浩馨， 胡中杰

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 肝病中心一科， 北京 100069

自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(SBP)是在肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的腹腔感染，是肝硬化等終末期肝病患者常見(jiàn)并發(fā)癥。肝硬化腹水住院患者SBP發(fā)生率為7%～30%[1]，并發(fā)SBP患者的病死率高達(dá)20%～30%[2]。然而，SBP的早期臨床診斷、早期病原學(xué)診斷及早期抗感染治療仍是臨床醫(yī)師面臨的巨大挑戰(zhàn)[3]。如何快速診斷和精準(zhǔn)治療一直都是研究的重點(diǎn)。因此，本文綜述分子診斷技術(shù)在SBP診斷中的研究成果及最新進(jìn)展。

1 SBP的診斷標(biāo)準(zhǔn)及現(xiàn)狀

所有腹水患者在入院時(shí)，無(wú)論是否懷疑有臨床感染，均應(yīng)進(jìn)行診斷性穿刺。目前，SBP國(guó)際上的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：在無(wú)明顯的腹腔內(nèi)、手術(shù)可治療的感染源情況下，嗜中性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)(PMN)≥250/mm3[4]。

理論上，通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌本身來(lái)診斷細(xì)菌感染是金標(biāo)準(zhǔn)，但臨床上往往很難實(shí)現(xiàn)。首先，樣本細(xì)菌數(shù)量少，導(dǎo)致細(xì)菌培養(yǎng)的敏感度相對(duì)較低：有研究[5]報(bào)道，即使在感染性休克中，血液細(xì)菌的培養(yǎng)陽(yáng)性率也只有69%。其次，Potgieter等[6]提出，在慢性病患者的血液中，存在大量有效休眠的微生物。這意味著細(xì)菌可以寄居在循環(huán)的免疫細(xì)胞中，無(wú)法被培養(yǎng)。第三，細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，而抗菌治療時(shí)機(jī)的延誤可顯著增加病死率。最后，部分細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性的患者沒(méi)有腹膜炎的相關(guān)臨床癥狀，即所謂的細(xì)菌性腹水，在國(guó)際SBP的診斷指南中，腹水培養(yǎng)陽(yáng)性也不是診斷SBP的必要條件[7]。

2 SBP的分子診斷原理及應(yīng)用現(xiàn)狀

近年來(lái)，細(xì)菌DNA(bacterial DNA,bactDNA)檢測(cè)和測(cè)序已被應(yīng)用于多種傳染病的診斷，分子技術(shù)可以在4～5 h內(nèi)檢測(cè)出少量的細(xì)菌DNA[4,8-9]。特別是對(duì)生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌和生物化學(xué)上無(wú)法識(shí)別的細(xì)菌，用分子技術(shù)進(jìn)行鑒定顯得尤為重要。隨著分子診斷技術(shù)的不斷優(yōu)化與發(fā)展，為SBP的診斷提供了機(jī)遇。

2.1 細(xì)菌DNA的診斷原理 細(xì)菌易位是肝硬化腹水并發(fā)細(xì)菌感染的重要病理機(jī)制，小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，當(dāng)達(dá)到一個(gè)臨界閾值可能易位進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)、血液，最后進(jìn)入腹水[10]。2002年,Such等[11]利用基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，首次在培養(yǎng)陰性的腹水和血液中檢測(cè)到細(xì)菌DNA，并提出通過(guò)檢測(cè)腹水或血液樣本的病原體核酸來(lái)作為細(xì)菌易位的替代標(biāo)志。但越來(lái)越多的證據(jù)表明，細(xì)菌易位可以是活菌，也可以是游離DNA[12]。因此，采用外切酶對(duì)樣本中游離核酸進(jìn)行預(yù)處理，可減少游離核酸對(duì)活菌DNA檢測(cè)的干擾，能更準(zhǔn)確反映樣本中存在的具有感染性的活致病原[13]。然而，檢測(cè)到細(xì)菌DNA是否便可以診斷SBP呢？

2.2 細(xì)菌DNA定性不足以診斷SBP 2008年,Zapater等[14]分析了156例非感染性肝硬化腹水患者在12個(gè)月內(nèi)的臨床轉(zhuǎn)歸，結(jié)果表明，檢出細(xì)菌DNA的患者病死率較高，但bactDNA的存在并不能預(yù)測(cè)SBP的發(fā)展。2016年,Bruns等[15]在218例肝硬化合并感染癥狀的患者中發(fā)現(xiàn)，超過(guò)70%的肝硬化以及慢加急性肝衰竭患者的循環(huán)或腹水中存在bactDNA，但臨床證實(shí)沒(méi)有血流或腹腔感染。

bactDNA定性不足以診斷SBP可能的原因是：第一，細(xì)菌易位時(shí)被循環(huán)免疫細(xì)胞破壞而暴露出bactDNA，使得細(xì)菌DNA片段存于血液或腹水中，但尚不足以引起感染[16]。第二，腹水通過(guò)調(diào)理作用、白細(xì)胞吸引作用抑制細(xì)菌活性或殺死細(xì)菌[17]，在這過(guò)程中，細(xì)菌代謝產(chǎn)物可持續(xù)存在并被檢測(cè)到。

2.3 細(xì)菌DNA的定量檢測(cè)比定性檢測(cè)可能更有助于SBP的診斷 2014年，Krohn等[18]提出用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Q-PCR)來(lái)檢測(cè)腹水中細(xì)菌量的問(wèn)題。2019年,Alvarez-Silva等[19]通過(guò)Q-PCR定量檢測(cè)bactDNA，發(fā)現(xiàn)失代償期肝硬化患者的腹水bactDNA定量與SBP沒(méi)有直接關(guān)系。Fagan等[20]在培養(yǎng)陰性的非中性粒細(xì)胞增高性腹水中發(fā)現(xiàn)，低水平細(xì)菌數(shù)量與炎癥標(biāo)志物關(guān)系不大，但bactDNA水平與中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)。由此可見(jiàn)，SBP的發(fā)展不僅僅基于bactDNA的存在，也與其數(shù)量相關(guān)。

值得注意的是，在SBP的發(fā)生中，消化道屏障是第一道防線，而腹膜免疫功能則是關(guān)鍵的第二道防線[17]。在肝硬化非感染性腹水中，宿主的腹膜免疫反應(yīng)可以有效控制低水平的細(xì)菌，從而降低患者的SBP發(fā)病率和病死率。Q-PCR檢測(cè)也有其技術(shù)局限性，需要標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，而不同分子遺傳學(xué)方法檢測(cè)到的腹水bactDNA有很大的差異[15]。因此，分子診斷技術(shù)也需要不斷地優(yōu)化與進(jìn)步。另外，肝硬化腹水患者臨床病情復(fù)雜多樣，腹水量的變化對(duì)細(xì)菌絕對(duì)數(shù)量的判斷也可能有影響，但有關(guān)腹水量的變化和細(xì)菌數(shù)量之間的關(guān)系尚未有研究報(bào)道。因此，在檢測(cè)分析bactDNA的絕對(duì)水平時(shí)，也要考慮腹水量的變化。

2.4 細(xì)菌DNA數(shù)量結(jié)合其種類能更精準(zhǔn)地判斷SBP 細(xì)菌易位后是否引起感染，與宿主的防御、免疫功能，細(xì)菌的毒力及數(shù)量有關(guān)。細(xì)菌的毒力取決于細(xì)菌的種類。從細(xì)菌培養(yǎng)的結(jié)果來(lái)看，革蘭陰性菌、厭氧菌和腸球菌是造成肝硬化感染最常見(jiàn)的病原菌[21]。但隨著侵入性操作在臨床上的逐漸應(yīng)用，外源性感染途徑(如中心靜脈置管、經(jīng)頸靜脈肝內(nèi)門體分流術(shù))也逐漸增多。近十年來(lái)，葡萄球菌的感染率呈逐年增加的趨勢(shì)[22]。

2019年，Alvarez-Silva等[19]研究10例失代償期肝硬化患者腹水和血液的菌群特征發(fā)現(xiàn)，根據(jù)α-多樣性指數(shù)，在屬水平上腹水菌群多樣性要高于血液。腹水中最常見(jiàn)的是紫色桿菌屬、沙門菌屬、皺紋單胞菌屬。Chen等[23]發(fā)現(xiàn)，肝硬化腹水患者中，SBP發(fā)生率較高者，在門水平上以α-變形桿菌和γ-變形菌為主，尤其是莫拉氏菌和不動(dòng)桿菌，這兩類種群也是臨床上重要的致病菌群。而病死率較高者主要以擬桿菌門和壁厚菌門為主，研究[24]表明這兩類群在腸道中占主導(dǎo)地位，可能是此類患者腸道黏膜屏障嚴(yán)重受損，從而造成病死率較高。近年來(lái)，隨著預(yù)防性抗菌藥物的應(yīng)用，因耐藥菌感染導(dǎo)致病死亡率明顯增加,尤其在亞洲地區(qū)[25]。最近一項(xiàng)關(guān)于全球耐藥菌的研究[26]發(fā)現(xiàn)，法國(guó)、意大利等國(guó)家以產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶的腸桿菌科多見(jiàn)；法國(guó)以萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌多見(jiàn)；荷蘭、英國(guó)等地以甲氧西林耐藥葡萄球菌多見(jiàn)。在亞洲，耐碳青霉烯類腸桿菌科和鮑曼氏菌比較普遍[25]。但是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌科仍然是近年來(lái)最常見(jiàn)的多重耐藥菌。由此可見(jiàn)，檢測(cè)特定種類的細(xì)菌DNA可能比僅僅檢測(cè)細(xì)菌DNA的存在更重要。但分析特定細(xì)菌的種類和數(shù)量與臨床結(jié)果及系統(tǒng)性炎癥之間的關(guān)系尚待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，SBP是肝病進(jìn)展的一個(gè)重要標(biāo)志，也是終末期肝病的一個(gè)決定性分水嶺。分子診斷技術(shù)為提高SBP的診斷效率提供了可能，2011年，Soriano等[27]采用PCR和測(cè)序技術(shù)檢測(cè)16S rDNA基因的方法對(duì)SBP的診斷做了一些探索，然而從對(duì)SBP診斷標(biāo)準(zhǔn)的認(rèn)識(shí)，連續(xù)標(biāo)本的動(dòng)態(tài)變化，以及分子檢測(cè)技術(shù)的提高等方面的不足使得此技術(shù)沒(méi)有真正應(yīng)用于臨床實(shí)踐，在Gu等[28]運(yùn)用分子診斷技術(shù)進(jìn)行快速病原學(xué)檢測(cè)的研究中，發(fā)現(xiàn)宏基因組測(cè)序(mNGS)技術(shù)對(duì)細(xì)菌檢測(cè)的靈敏度和特異度分別為79%和91%，在12例體液培養(yǎng)或PCR陰性但臨床判定最終確定了感染性診斷的患者中，60%的mNGS陽(yáng)性。

因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)SBP進(jìn)行診斷具有巨大的潛能，通過(guò)對(duì)微生物進(jìn)行定性定量的分析，以及根據(jù)測(cè)序結(jié)果對(duì)細(xì)菌種類進(jìn)行判定，能夠更好的解釋臨床問(wèn)題并服務(wù)于臨床實(shí)踐，所以仍需要進(jìn)一步的研究。

3 展望

(1)肝硬化細(xì)菌性腹水發(fā)生率逐年上升可能是細(xì)菌的短暫定植，需要更加精確的定性定量分子技術(shù)以及宏基因測(cè)序進(jìn)一步研究。(2)需要新的生物標(biāo)志物指導(dǎo)抗菌藥物的應(yīng)用，并評(píng)估抗菌藥物的治療效果。(3)通過(guò)細(xì)菌DNA的數(shù)量及分層從而準(zhǔn)確地描述肝硬化腹水的菌群特征，提供新的診斷依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：吳浩馨負(fù)責(zé)文獻(xiàn)檢索和論文撰寫；胡中杰負(fù)責(zé)論文審校。