非酒精性脂肪性肝病體外模型的研究進(jìn)展

盧曉臣， 韓紅梅

延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 吉林 延吉 133000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是在無過量飲酒的情況下出現(xiàn)肝脂肪堆積，并且至少5%的肝細(xì)胞存在脂肪變性[1-2]，其疾病譜包括非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化以及肝細(xì)胞癌[3]。最近研究[4]發(fā)現(xiàn)，高達(dá)30%的NAFL患者可發(fā)展為NASH。而且成人中NAFLD的全球患病率約25%[5]，在一些國家已成為肝移植最常見的原因[6]。然而，目前仍無針對(duì)NAFLD的特異性藥物。在發(fā)病機(jī)制方面最受認(rèn)可的是“多次打擊”學(xué)說[7]，NAFLD體外和體內(nèi)模型在相關(guān)研究中發(fā)揮重要作用。本文將NAFLD體外模型的研究進(jìn)展總結(jié)如下，主要從細(xì)胞系和培養(yǎng)方式兩方面闡述。

1 不同細(xì)胞系在NAFLD體外模型中的應(yīng)用

1.1 原代細(xì)胞

原代細(xì)胞是使用兩步膠原酶灌注或利用磁性細(xì)胞分離技術(shù)從切除的肝組織中分離出來的細(xì)胞。原代細(xì)胞在很短的時(shí)間內(nèi)可保持其來源的形態(tài)和功能特征，然而其生命和擴(kuò)增能力有限，不適于研究長期培養(yǎng)。

1.1.1 人原代肝細(xì)胞(primary human hepatocyte, PHH) PHH是直接從人肝組織中分離獲得的，最接近體內(nèi)肝細(xì)胞表型[8]。Huang等[9]將PHH暴露于15 μg/mL棕櫚酸中48 h，建立NAFLD細(xì)胞模型后，用文蛤寡肽處理24 h，發(fā)現(xiàn)文蛤寡肽通過提高超氧化物歧化酶活性，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，同時(shí)文蛤寡肽通過減少磷酸化氨基末端蛋白激酶和促凋亡蛋白基因Bax表達(dá)，降低半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3活性，發(fā)揮抗凋亡作用。正常肝組織在臨床實(shí)踐中很難獲得，需要倫理授權(quán)，并且其分離和培養(yǎng)比較復(fù)雜。雖然目前PHH已被產(chǎn)品化，易購買，然而PHH具有供體之間的遺傳變異以及表型不穩(wěn)定問題，可能引起偏差，導(dǎo)致研究缺乏可重復(fù)性[10-11]。因此，PHH似乎特別適用于不需要長時(shí)間培養(yǎng)的藥物代謝研究，在較小程度上適用于NAFLD的建模。

1.1.2 嚙齒動(dòng)物原代肝細(xì)胞 嚙齒動(dòng)物的原代肝細(xì)胞廣泛用于研究肝內(nèi)甘油三酯 (TG)代謝的過程，尤其是酯化過程及如何影響脂肪酸進(jìn)入氧化途徑，以及可能影響肝內(nèi)TG通過極低密度脂蛋白輸出的因素。嚙齒動(dòng)物的原代肝細(xì)胞與PHH相比更易獲得，但是僅能部分復(fù)制人類的NAFLD模型[12]。Ju等[13]對(duì)雄性C57BL/6小鼠的肝門靜脈內(nèi)灌注漢克斯氏平衡鹽溶液后分離出肝組織，然后用含膠原酶(Ⅰ和Ⅳ型)的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，離心獲得小鼠原代肝細(xì)胞。將獲得的小鼠原代肝細(xì)胞以及用富含半胱氨酸61 蛋白(cysteine-rich protein 61，Cyr61或CCN1)干預(yù)后的小鼠原代肝細(xì)胞，暴露于0.5 mmol/L的游離脂肪酸(free fat acid，F(xiàn)FA)(油酸∶棕櫚酸=2∶1)中培養(yǎng)24 h，成功誘導(dǎo)建立NAFLD細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)CCN1增加了小鼠原代細(xì)胞內(nèi)TG水平，增加了TNFα、單核細(xì)胞趨化蛋白1、凋亡相關(guān)蛋白水平，同時(shí)也提高了半胱天冬酶-3和促凋亡蛋白基因Bax的表達(dá)水平，提示CCN1促進(jìn)了NAFLD的進(jìn)展。另有研究[14]利用24～32 d的雌性C57BL6J小鼠獲得原代肝細(xì)胞，然后將原代肝細(xì)胞加入含有棕櫚酸濃度梯度為0～0.1 mmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)0.02 mmol/L棕櫚酸培養(yǎng)的肝細(xì)胞具有最高的細(xì)胞活力和脂肪積累率，并發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂可通過抑制蛋白激酶C/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽氧化酶信號(hào)途徑減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的小鼠原代肝細(xì)胞脂肪變性。

1.2 傳代細(xì)胞

在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞稱為傳代細(xì)胞。傳代細(xì)胞顯示出比原代細(xì)胞更高的復(fù)制能力和穩(wěn)定的表型，具有高可用性、易于處理和無限的使用壽命的優(yōu)點(diǎn)，成為有吸引力的造模細(xì)胞，然而其在傳代過程中，一些細(xì)胞會(huì)發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，導(dǎo)致難以培養(yǎng)，從而限制了其應(yīng)用[15]。以下介紹幾個(gè)常用的傳代細(xì)胞。

1.2.1 HepG2細(xì)胞 HepG2細(xì)胞是來源于肝母細(xì)胞瘤的一種上皮細(xì)胞，并保留了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的幾種生化功能，不僅易于處理，而且有無限的使用壽命。因此，HepG2細(xì)胞已成為有吸引力的模型細(xì)胞。制備NAFLD細(xì)胞模型時(shí)，通常用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，多采用油酸、油酸和棕櫚酸、脂肪乳劑以及引起脂質(zhì)堆積的培養(yǎng)液等誘導(dǎo)。這可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)TG水平升高105%～1100%，在油紅O染色下可觀察到細(xì)胞內(nèi)大量脂滴積累、胞質(zhì)內(nèi)充滿大量大小不一的橘紅色脂滴、細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量較少、內(nèi)嵴數(shù)量減少、脂滴形態(tài)學(xué)變化極為明顯[16]。因此，HepG2細(xì)胞曾一度作為在NAFLD細(xì)胞模型研究中最常用的細(xì)胞。然而，HepG2細(xì)胞畢竟來源于腫瘤細(xì)胞，與正常肝細(xì)胞相比，兩者的生理?xiàng)l件存在很大差異，而且腫瘤細(xì)胞代謝較快，導(dǎo)致藥物作用的時(shí)間太短，而無法觀察到藥效。因此，目前HepG2細(xì)胞主要用于NAFLD脂質(zhì)代謝研究。

1.2.2 HuH7細(xì)胞 HuH7細(xì)胞來源于高分化的肝細(xì)胞癌，具有無限的生長潛力，而且在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)均具有穩(wěn)定的表型。HuH7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞具有相似的缺點(diǎn)，目前也是主要用于NAFLD脂質(zhì)代謝研究。

1.2.3 HepaRG細(xì)胞 源自人類肝細(xì)胞癌的HepaRG細(xì)胞具有一些肝祖細(xì)胞的特征和特性(可以轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞)。HepaRG細(xì)胞表達(dá)各種酶和受體(如組成性雄甾烷受體、孕烷X 受體、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶等)，并且在功能蛋白表達(dá)上不遜于PHH，因此HepaRG細(xì)胞已被推薦用于藥物代謝和毒性研究[17]，是研究NAFLD藥物開發(fā)方面具有潛力和優(yōu)勢的細(xì)胞系。

1.2.4 LO2細(xì)胞 LO2細(xì)胞是永生化的人正常肝細(xì)胞，具有正常肝細(xì)胞的生物學(xué)特性和肝功能，通過誘導(dǎo)構(gòu)建的高脂細(xì)胞模型，能建立一種接近于臨床的NAFL或NASH肝細(xì)胞模型，與HepG2細(xì)胞相比，LO2細(xì)胞更適于NAFLD細(xì)胞篩藥模型研究。LO2細(xì)胞通常用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，多采用油酸、胎牛血清、油酸和棕櫚酸、脂肪乳等，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)并成功建立細(xì)胞模型后，細(xì)胞內(nèi)TG水平升高32%～428%，油紅O染色觀察到細(xì)胞明顯增大，細(xì)胞內(nèi)有較多較大的紅色脂肪滴，甚至出現(xiàn)脂肪滴的融合現(xiàn)象，趨向于大泡性脂肪樣變，細(xì)胞內(nèi)脂滴形態(tài)學(xué)變化極為明顯[16]。近幾年LO2細(xì)胞常用于建立NAFLD細(xì)胞模型。

1.3 肝細(xì)胞樣細(xì)胞(hepatocyte-like cell，HLC) HLC是由人類干細(xì)胞分化而來的細(xì)胞，包括肝干細(xì)胞和胚胎多能干細(xì)胞[18]。人類干細(xì)胞在生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)的聯(lián)合培養(yǎng)下可在體外分化為HLC[19]。Deepak等[20]采用葡萄糖攝取法測定HLC的功能，并與PHH進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩種細(xì)胞類型中，葡萄糖的攝取量大致相同，提示HLC的功能類似于PHH。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)采用油酸和棕櫚酸(75 μmol/L∶25 μmol/L)的脂質(zhì)混合物處理HLC 24 h，建立了體外NAFL模型，發(fā)現(xiàn)與NAFL進(jìn)展相關(guān)的基因如水通道蛋白1、Ⅲ型膠原蛋白α1和Ⅰ型膠原蛋白α1基因表達(dá)增加，這些基因已被證實(shí)為NAFLD疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物[21]。另一項(xiàng)研究[22]將HLC加入含有乳酸鈉、丙酮酸鈉和辛酸(10 mmol/L∶1 mmol/L∶2 mmol/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)NASH線粒體功能障礙相關(guān)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(如細(xì)胞死亡活化蛋白抗體、醛酮還原酶AKR1C2和醛酮還原酶AKR1C4)含量減少及其相關(guān)的代謝產(chǎn)物?；鈮A和肉堿代謝產(chǎn)物失調(diào)，這些表現(xiàn)與NASH早期患者中觀察到的一致，該模型對(duì)研究已知遺傳背景的NAFLD發(fā)病機(jī)制具有重要意義。HLC雖然不受培養(yǎng)時(shí)間的限制，具有與原代肝細(xì)胞相似的形態(tài)學(xué)和功能特征，但是HLC也具有胚胎干細(xì)胞的倫理問題、細(xì)胞分化不完全和缺乏標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)方案等缺點(diǎn)，從而一定程度上限制了相關(guān)研究的可重復(fù)性[11]。

2 不同培養(yǎng)方式的NAFLD體外模型

2.1 二維細(xì)胞培養(yǎng)模型

2.1.1 二維單細(xì)胞培養(yǎng)模型 目前為止，大多數(shù)體外研究都利用二維單層肝細(xì)胞培養(yǎng)來闡明NAFL所涉及的分子機(jī)制。二維單層肝細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)方法足夠成熟，選擇各種細(xì)胞和培養(yǎng)方法較為簡單，然而不能長時(shí)間(通常為12～48 h)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，未能研究TG長期積累導(dǎo)致的變化，更為重要的是二維單層細(xì)胞培養(yǎng)不僅不能代表人類組織的復(fù)雜性，還缺乏關(guān)鍵的肝細(xì)胞-非實(shí)質(zhì)細(xì)胞相互作用[23]。

2.1.2 二維共同培養(yǎng)細(xì)胞模型 在體內(nèi)肝組織的復(fù)雜結(jié)構(gòu)中，兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的相互作用是一種普遍現(xiàn)象，而且肝臟中的非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞如Kupffer細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞在肝細(xì)胞的存活和功能中也起重要作用[24]。因此，迫切需要研究NAFLD進(jìn)展過程中反映細(xì)胞間相互作用的體外模型。已有研究[25]表明，原代肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞共同培養(yǎng)后，提高了肝細(xì)胞活力和功能。Barbero-Becerra等[26]將LX-2肝星狀細(xì)胞細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)或HuH7肝細(xì)胞和LX-2肝星狀細(xì)胞共同培養(yǎng)于1200 μmol/L濃度的FFA(棕櫚酸和油酸之比為1∶2)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，建立NAFLD模型，結(jié)果提示Huh7肝細(xì)胞與LX-2肝星狀細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)顯著表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)，證明了肝星狀細(xì)胞的激活需要細(xì)胞間的相互作用。Anfuso等[27]將LX-2肝星狀細(xì)胞和Huh7肝細(xì)胞獨(dú)立培養(yǎng)或共同培養(yǎng)(LX-2肝星狀細(xì)胞和Huh7肝細(xì)胞之比為1∶5)，分別加入含有1200 μmol/L的FFA(油酸與棕櫚酸之比為2∶1)培養(yǎng)基中96 h，建立NASH模型，然后加入5 μmol/L水飛薊賓一起培養(yǎng)24、96和144 h，發(fā)現(xiàn)活性氧在共同培養(yǎng)模型中減少最明顯，水飛薊賓的抗氧化作用在共同培養(yǎng)中最明顯，從而證明了肝細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞之間的串?dāng)_不僅體現(xiàn)在NASH的疾病進(jìn)程中，而且在治療NASH方面也具有重要意義。Jain等[28]將HepG2肝細(xì)胞和LX-2肝星狀細(xì)胞(5∶1)共同培養(yǎng)于含有0.75 mmol/L棕櫚酸的培養(yǎng)基中16 h，建立NASH細(xì)胞模型，評(píng)估了Saroglitazar、吡格列酮和非諾貝特的藥物作用，發(fā)現(xiàn)Saroglitazar減輕線粒體功能障礙、NF-κB磷酸化和肝星狀細(xì)胞的激活方面優(yōu)于另外兩種藥物。二維共同培養(yǎng)細(xì)胞模型是將不同類型的細(xì)胞放在同一環(huán)境中一起培養(yǎng)，并且可以通過向培養(yǎng)基中添加FFA誘導(dǎo)脂肪變性。因此，二維共同培養(yǎng)細(xì)胞模型主要用于研究體外肝細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用，是研究細(xì)胞之間串?dāng)_的重要工具。但是缺點(diǎn)是很難實(shí)施，操作起來比較復(fù)雜。

2.2 三維細(xì)胞培養(yǎng)模型

2.2.1 三明治培養(yǎng)模型 為了克服部分單層培養(yǎng)中原代肝細(xì)胞功能和形態(tài)的迅速改變，研究人員[9]開發(fā)了三明治培養(yǎng)模型，即肝細(xì)胞放置于兩層膠原蛋白凝膠之間，研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞至少能維持6周的糖原合成和儲(chǔ)存、尿素生成、血漿蛋白合成和分泌、脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)、膽汁酸合成和重?cái)z取，而肝細(xì)胞和膠原蛋白在單層培養(yǎng)時(shí)，則1～2周內(nèi)停止這種分泌。最近開發(fā)了一種更復(fù)雜的三明治培養(yǎng)模型，模擬肝小葉結(jié)構(gòu)，將肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在膠原蛋白凝膠中共同培養(yǎng)，通過肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞之間的接觸，增強(qiáng)了肝細(xì)胞的功能和存活率[29]。然而，在三明治培養(yǎng)模型中，由于膠原蛋白的厚度，細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用可能被隱藏或阻塞，因此，三明治培養(yǎng)模型很少用于NAFLD模型[11]。

2.2.2 肝球體 肝球體是目前最常用的三維培養(yǎng)模型。球狀體的形成是由肝細(xì)胞的自我聚集引起的，不需要非黏附表面和重力黏附等技術(shù)干預(yù)。Kozyra等[30]將肝球體(由PHH和少量的Kupffer細(xì)胞和星狀細(xì)胞組成)與反映NAFLD患者肝臟體內(nèi)環(huán)境的FFA、葡萄糖和胰島素混合液中(濃度分別為320 μmol/L、5.5 mmol/L、0.1 nmol/L)共同培養(yǎng)3周，隨后停止向培養(yǎng)基中加入其混合液，加入不同劑量的抗脂肪變性化合物(如二甲雙胍、胰高血糖素、奧拉帕尼等)共同培養(yǎng)10 d，發(fā)現(xiàn)FFA、胰島素和碳水化合物的混合液促進(jìn)了肝細(xì)胞中脂質(zhì)的積累，增加了脂肪合成基因(脂肪酸合酶)的表達(dá)；抗脂肪變性化合物降低了脂質(zhì)含量，進(jìn)一步證實(shí)了脂肪變性的可逆性。另有研究[31]將PHH、肝星狀細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞組成的肝球體加入含有0.5 mmol/L棕櫚酸的培養(yǎng)基(加入或不加入凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-1抑制劑的情況下)中培養(yǎng)9 d，成功建立NASH模型，在此模型中，棕櫚酸顯著增加了α-SMA、基質(zhì)金屬蛋白酶1和血小板衍生生長因子受體β基因的表達(dá)，結(jié)果顯示凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-1抑制劑顯著降低棕櫚酸誘導(dǎo)的NASH的炎癥反應(yīng)和肝纖維化。Pingitore等[32]將肝球體(HepG2細(xì)胞和LX-2細(xì)胞之比為24∶1)加入含有500 μmol/L的FFA(棕櫚酸和油酸之比為1∶2)中培養(yǎng)48 h，建立NASH細(xì)胞模型(脂質(zhì)的積累、Ⅰ型膠原蛋白的水平升高和α-SMA的表達(dá)增多)，隨后將球狀體與利拉魯肽或Elfibranor(治療NASH的臨床試驗(yàn)藥物)一起培養(yǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)利拉魯肽或Elfibranor減輕了NASH表型。類似一些研究也是利用肝球體建立NASH模型，觀察一些藥物對(duì)NASH的療效[33]。肝球體可以作為一種有價(jià)值的NAFLD體外模型，有助于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)，可以成為合適的藥物篩選模型。然而，實(shí)際操作時(shí)很難保持均勻的球體大小，并且會(huì)出現(xiàn)球狀簇，限制球體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)和氧的吸收，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

2.2.3 肝類器官 肝類器官是體外聯(lián)合培養(yǎng)的具有細(xì)胞-細(xì)胞/細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的組織特異性細(xì)胞的集合，可概括體內(nèi)肝臟的形態(tài)和功能特征。肝類器官與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，具有明顯的優(yōu)勢，即肝類器官可以更緊密地模擬自然生理過程，包括干細(xì)胞分化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞間相互作用。此外，肝類器官還可以進(jìn)行廣泛的擴(kuò)增和培養(yǎng)，并保持其基因組學(xué)穩(wěn)定性，從而可以長期保存[34]。Ouchi團(tuán)隊(duì)[35]采用不同濃度的油酸(200、400、800 μmol/L)處理多能干細(xì)胞衍生的肝類器官導(dǎo)致脂質(zhì)積累，發(fā)現(xiàn)隨著油酸濃度增加，脂質(zhì)積累也會(huì)增加，當(dāng)采用油酸培養(yǎng)肝類器官5 d后，觀察到了NASH典型表現(xiàn)包括肝細(xì)胞的氣球樣變，IL-8、Ⅲ型前膠原氨基端原肽和α-SMA表達(dá)的上調(diào)以及膠原蛋白的沉積，隨后加入法尼酯X受體激動(dòng)劑FGF19藥物2 d后，發(fā)現(xiàn)上述表現(xiàn)明顯改善。Kruitwagen等[36]利用貓肝祖細(xì)胞衍生的貓肝類器官加入含有FFA(0.4 mmol/L油酸酯和0.2 mmol/L棕櫚酸酯)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，建立NAFLD模型；并有研究[37]發(fā)現(xiàn)T863(二?；视王；D(zhuǎn)移酶1 抑制劑)以及AICAR(AMPK激動(dòng)劑)兩種藥物降低脂質(zhì)蓄積，為評(píng)估這些藥物用于NAFLD的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。Wang等[38]采用FFA誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的肝類器官建立了NASH細(xì)胞模型，表現(xiàn)為脂質(zhì)積累，上調(diào)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因(載脂蛋白C2、肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶2和肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A)的表達(dá)，增加了活性氧、各種炎性標(biāo)記物(IL-8、IL-6、TNFα、單核細(xì)胞趨化蛋白-1)和纖維化標(biāo)志物(α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白)的水平。肝類器官源自患者組織活檢或多能干細(xì)胞，可包含多種細(xì)胞類型，具有與原生肝器官類似的結(jié)構(gòu)和功能，已成為研究肝生理學(xué)和病理生理學(xué)的新型體外工具，通常用于疾病建模和藥物篩選。然而，肝類器官可能會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞分化不完全，不包括肝臟中存在的所有細(xì)胞,仍無法表現(xiàn)出完整的肝功能以及血管化、免疫化、神經(jīng)支配等[39]。

2.2.4 肝芯片 肝芯片是一種三維體外肝微生理系統(tǒng)，是模擬肝細(xì)胞狀態(tài)和肝動(dòng)態(tài)理化環(huán)境的高通量系統(tǒng)。肝芯片的微結(jié)構(gòu)是由聚合物支架構(gòu)成，該支架由數(shù)百個(gè)小通道組成。這樣的結(jié)構(gòu)使得當(dāng)肝細(xì)胞被植入這些通道時(shí)，肝芯片中的聚合物支架會(huì)排列成長長的甜甜圈狀，非常類似于肝小葉，而且將含有各種營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的微流體模擬血流。因此，肝芯片極大地增加了體外模擬NAFLD的可能性，是了解脂質(zhì)代謝異常的重要方法。Gori等[40]利用FFA(0.33 mmol/L棕櫚酸和0.66 mmol/L油酸)培養(yǎng)肝芯片(植入HepG2細(xì)胞)48 h，成功建立NAFL模型，該設(shè)備模擬了肝竇的內(nèi)皮-實(shí)質(zhì)界面，并允許營養(yǎng)成分的擴(kuò)散和廢物的清除，類似于肝臟的微循環(huán)，反映了NAFLD患者體內(nèi)脂質(zhì)積累過程。Lee等[41]研發(fā)了一種腸-肝芯片，并評(píng)價(jià)了α-硫辛酸、丁酸鹽、TNFα對(duì)脂肪變性的影響，該芯片由腸側(cè)膠原支架多孔膜隔開的兩個(gè)腔室組成，Caco-2腸細(xì)胞植入腸腔，HepG2肝細(xì)胞植入肝腔，加入含有3.8 mmol/L濃度的FFA(油酸和棕櫚酸之比為2∶1)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)或其內(nèi)分別加入α-硫辛酸、丁酸鹽、TNFα(濃度分別為2 mmol/L、2 mmol/L、25 ng/ml)培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)α-硫辛酸降低了芯片中TG積聚；丁酸鹽通過增強(qiáng)腸屏障功能嗎，減少肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累而減輕了脂肪變性；TNFα使Caco-2腸細(xì)胞的屏障功能受損，允許更多的FFA穿過屏障接觸HepG2細(xì)胞，從而增加了HepG2細(xì)胞脂肪變性。Freag等[42]開發(fā)了一種肝芯片，其包含PHH、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞，將該芯片培養(yǎng)于含有油酸、棕櫚酸和脂多糖(濃度分別為0.66 mmol/L、0.33 mmol/L、10 μg/mL)的培養(yǎng)基或其培養(yǎng)基內(nèi)加入Elafibranor藥物(過氧化物酶激活α受體和δ受體激動(dòng)劑)培養(yǎng)10 d，模型組表現(xiàn)出典型的NASH特征，包括細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積、肝細(xì)胞氣球樣變、肝星狀細(xì)胞活化、炎性標(biāo)志物(TNFα、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α和單核細(xì)胞趨化蛋白1)和纖維化標(biāo)志物(α-SMA、金屬蛋白酶組織抑制因子1和Ⅰ型膠原蛋白)的升高，Elafibranor干預(yù)組減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)約8倍，減少肝細(xì)胞氣球樣變約3倍，明顯降低肝星狀細(xì)胞活化、炎性和纖維化標(biāo)志物水平，從而顯著抑制了NASH進(jìn)展。肝芯片與二維培養(yǎng)相比，通過其微流體動(dòng)力學(xué)體現(xiàn)出更高的肝細(xì)胞活力、逐漸降低的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和較輕的氧化應(yīng)激；與肝類器官相比，肝芯片有標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)議和生物工程制造優(yōu)勢，具有更高的可重復(fù)性，然而肝芯片由于復(fù)雜度高和成本昂貴，并未得到廣泛應(yīng)用。

2.3 精密肝切片 精密肝切片(precision-cut liver slice，PCLS)是研究NAFLD機(jī)制方面的有效體外模型，PCLS維持了肝臟的細(xì)胞構(gòu)成和組織結(jié)構(gòu)，完整保留了肝藥酶和細(xì)胞器的活性，也保留了細(xì)胞之間的連接及一定的細(xì)胞間質(zhì)，因而更加接近體內(nèi)生理?xiàng)l件。Palma等[43]將人PCLS培養(yǎng)于含有FFA(油酸和亞油酸濃度均為0.1 mmol/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，模擬了NAFLD早期肝脂肪變性、脂質(zhì)沉積和脂毒性。Prins等[44]將大鼠PCLS加入模擬代謝綜合征的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，其含有葡萄糖、果糖、胰島素和棕櫚酸(濃度分別為25 mmol/L、5 mmol/L、1 nmol/L和240 μmol/L)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酰輔酶A羧化酶基因1和2的表達(dá)增加，肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1基因表達(dá)降低，表明早期脂肪變性是通過新生脂肪增加和線粒體β氧化減少而實(shí)現(xiàn)的。PCLS的主要局限是切片機(jī)價(jià)格昂貴，成本高、可重復(fù)性差、培養(yǎng)維持時(shí)間短和需要新鮮切除的肝組織等。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，本文總結(jié)了近幾年常用的NAFLD體外模型及在研NAFLD體外模型，這些模型為研究者根據(jù)自身研究目的選擇合適的細(xì)胞及培養(yǎng)條件提供幫助，為獲得高質(zhì)量研究成果提供保障。相信隨著對(duì)NAFLD認(rèn)識(shí)的不斷深入和突破，將會(huì)出現(xiàn)更穩(wěn)定、簡單有效、與NAFLD發(fā)病相關(guān)的病理生理學(xué)模型來促進(jìn)NAFLD發(fā)病機(jī)制及防治藥物的研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：盧曉臣負(fù)責(zé)分析資料，撰寫論文，修改論文；韓紅梅負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。