羅楚漩 何強(qiáng)

基因編輯是一種利用細(xì)菌核酸酶有效準(zhǔn)確地修改生物體基因組特定目標(biāo)基因，研究基因功能、構(gòu)建疾病模型以及治療特定疾病的新型基因工程技術(shù)[1-2]。目前常用的基因編輯技術(shù)主要包括鋅指核酸酶（zinc finger nucleases,ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases,TALEN）以及規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）/CRISPR相關(guān)蛋白質(zhì)（CRISPR-associated proteins,Cas）系統(tǒng)。然而，昂貴、費(fèi)時(shí)、剪切效率低等缺陷限制了前兩種技術(shù)在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種由細(xì)菌或古生菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)展而來(lái)的第三代基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，能夠快速有效地對(duì)基因組內(nèi)特定的DNA序列進(jìn)行編輯。由于其操作簡(jiǎn)單、效率高、特異性強(qiáng)、應(yīng)用多樣等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為目前最受研究人員歡迎的基因編輯技術(shù)。隨著CRISPR/Cas系統(tǒng)的出現(xiàn)，人類基因組研究發(fā)生了革命性的變化，人們能夠更好地理解單個(gè)基因產(chǎn)物對(duì)生物體疾病的貢獻(xiàn)。

已知許多腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制與遺傳因素密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)高達(dá)15%的病例直接源自孟德?tīng)柾蛔儯嗟牟±赡苌婕案鼮閺?fù)雜的遺傳模式[3]。雖然許多導(dǎo)致腎臟疾病的基因已經(jīng)被確認(rèn)，但還需要功能性實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證遺傳學(xué)研究中產(chǎn)生的候選基因，并確定突變?nèi)绾卧诩?xì)胞和組織水平上導(dǎo)致疾病。此外，還有許多未知的與腎臟疾病相關(guān)的基因等待研究人員進(jìn)一步探索。CRISPR/Cas系統(tǒng)使人們能夠進(jìn)行有針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)來(lái)解決這些問(wèn)題，更加深入地理解腎臟疾病的病理生理學(xué)，因此越來(lái)越多地被應(yīng)用于腎臟疾病的研究。本文主要從CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)、基本原理、分類及其在腎臟疾病研究中的應(yīng)用進(jìn)展等方面作一綜述，旨在為今后應(yīng)用該基因編輯技術(shù)進(jìn)行相關(guān)研究提供參考。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)概述

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)最早可以追溯到1987年，Ishino等[4]首次報(bào)道在革蘭陰性桿菌中發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)堿性磷酸酶同工酶轉(zhuǎn)化的iap基因中存在一段特殊的串聯(lián)間隔重復(fù)序列，且該序列在多種細(xì)胞功能中均發(fā)揮著重要的作用。隨后，人們相繼在革蘭陽(yáng)性菌、古生菌中也發(fā)現(xiàn)了相似序列[5]。2002年Jansen等[6]正式將其命名為CRISPR，并在含有CRISPR的原核生物中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)Cas基因。2005年Bolotin等[7]研究發(fā)現(xiàn)，間隔區(qū)基因與噬菌體已知基因之間存在一定的同源性，提示CRISPR/Cas系統(tǒng)可能是一種獲得性的免疫防御系統(tǒng)。2007年CRISPR/Cas系統(tǒng)被進(jìn)一步證實(shí)為原核生物的一種DNA修復(fù)機(jī)制，即病毒入侵后，細(xì)菌整合了噬菌體基因組序列的新間隔，通過(guò)去除或添加特定的間隔修飾細(xì)胞的噬菌體抗性表型[8]。2013年科學(xué)家們首次將CRISPR/Cas技術(shù)應(yīng)用于人類細(xì)胞和小鼠細(xì)胞的基因組編輯[9-10]。2020年四川大學(xué)盧鈾教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了全球首個(gè)采用CRISPR/Cas系統(tǒng)基因編輯人體臨床試驗(yàn)，為該技術(shù)進(jìn)一步向臨床研究轉(zhuǎn)化提供了重要依據(jù)[11]。CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)為基因組學(xué)研究開(kāi)辟了一條新途徑，對(duì)遺傳疾病和生物工程的應(yīng)用產(chǎn)生了重要的影響。

1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本原理 CRISPR/Cas系統(tǒng)通過(guò)引導(dǎo)核酸酶結(jié)合和剪切特定的核酸序列，為微生物提供針對(duì)外源基因元件的RNA引導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。雖然CRISPR/Cas系統(tǒng)的詳細(xì)作用機(jī)制目前尚未完全闡明，但該系統(tǒng)發(fā)揮作用大致包括以下3個(gè)過(guò)程：第1個(gè)過(guò)程為適應(yīng)，微生物捕獲外源基因片段，并將外源DNA或RNA片段整合進(jìn)基因組CRISPR序列；第2個(gè)過(guò)程為表達(dá)，將該外源片段轉(zhuǎn)錄成RNA，即CRISPR RNA（crRNA）；第三個(gè)過(guò)程為干預(yù)，在crRNA引導(dǎo)下，通過(guò)RNA-RNA或RNA-DNA配對(duì)，Cas蛋白作用于外源入侵DNA使其降解[12]。

1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類 2011年Makarova等[13]將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為3種類型和未分類的系統(tǒng)。Ⅰ型CRISPR/Cas系統(tǒng)主要包含Cas3基因。該基因不僅編碼具有解旋酶和DNA酶活性的蛋白質(zhì)，而且編碼包含不同組分的級(jí)聯(lián)復(fù)合物[14]。Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)只存在于細(xì)菌中，該系統(tǒng)中的特征基因Cas9被證實(shí)能夠產(chǎn)生crRNA和切割目標(biāo)DNA。Ⅲ型CRISPR/Cas系統(tǒng)常見(jiàn)于古生菌中，該系統(tǒng)的特征基因Cas10能夠編碼一種結(jié)構(gòu)域與核酸聚合酶和核酸環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域同源的蛋白[15]。

近年來(lái)，隨著對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)認(rèn)識(shí)的不斷深入，2015年Makarova等[16]對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行重新分類。根據(jù)干預(yù)階段參與蛋白，新的分類將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為2大類，需要多個(gè)蛋白協(xié)同作用被分為1類系統(tǒng)，只需要一個(gè)蛋白參與的被分為2類系統(tǒng)。由于2類CRISPR/Cas系統(tǒng)組分較為簡(jiǎn)單，該系統(tǒng)成為目前研究最多、應(yīng)用較為廣泛的系統(tǒng)。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)在腎臟疾病研究中的應(yīng)用

2.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)在研究腎臟疾病治療靶點(diǎn)中的應(yīng)用

2.1.1 腎間質(zhì)纖維化 腎間質(zhì)纖維化是各種病因?qū)е碌穆阅I臟病不斷進(jìn)展的共同最終途徑，以細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度生成和沉積為主要特征，被認(rèn)為是導(dǎo)致腎功能損害的常見(jiàn)原因之一[17]。然而目前腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。CRISPR/Cas系統(tǒng)為腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制研究提供了新手段。大量研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β（transforming growth factor β,TGF-β）在組織纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用[18]。然而，抑制TGF-β預(yù)防纖維化的同時(shí)也會(huì)破壞其抗炎和創(chuàng)面愈合作用[19]。因此，如何平衡這兩種相反的作用成為一個(gè)主要的臨床難題。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是大多數(shù)TGF-β信號(hào)通路中常見(jiàn)的輔助因子。既往有研究表明，β-catenin與T細(xì)胞因子（T-cell factor,TCF）結(jié)合時(shí)可激活促纖維化基因，而與叉頭轉(zhuǎn)錄因子（forkhead transcription factor O,FoxO）結(jié)合則促進(jìn)細(xì)胞在氧化應(yīng)激下的存活。2019年Rao等[20]采用CRISPR/Cas系統(tǒng)特異性敲除小鼠腎小管上皮細(xì)胞中的FoxO1或TCF1，證實(shí)了FoxO1可以抵抗TGF-β誘導(dǎo)的促纖維化蛋白表達(dá)，而TCF小分子抑制劑可預(yù)防單側(cè)輸尿管梗阻腎纖維化。該研究結(jié)果揭示了FoxO是腎間質(zhì)纖維化的潛在治療靶點(diǎn)。

2.1.2 急性腎損傷 急性腎損傷是一種以腎功能迅速下降、氮質(zhì)血癥、少尿或無(wú)尿?yàn)橹饕卣鞯木C合征[21]。既往有研究表明，Klotho可防止腎臟損傷，該基因在衰老和急性腎損傷后表達(dá)減少[22-23]。IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，可改善順鉑治療后的腎損傷[24-25]。大多數(shù)CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)揮基因編輯作用主要依賴于誘導(dǎo)DNA雙鏈的斷裂，但DNA雙鏈斷裂引起的不必要的突變可能會(huì)帶來(lái)有害的影響，因此影響了它們?cè)谂R床治療中的應(yīng)用?？茖W(xué)家們開(kāi)發(fā)了一種新型的Cas9蛋白，這種蛋白不僅能結(jié)合到基因組上的特點(diǎn)位置，而且不會(huì)造成雙鏈DNA的斷裂[26]。這些Cas9蛋白和另一些能影響基因表達(dá)的分子開(kāi)關(guān)蛋白融合在一起，能起到轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的作用，從而定點(diǎn)啟動(dòng)特定的基因。腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus,AAV）是一類結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的單鏈DNA缺陷型病毒，目前被認(rèn)為是一種相對(duì)安全的基因轉(zhuǎn)移載體，可以感染多種類型的細(xì)胞，包括分裂和非分裂細(xì)胞，在臨床前研究中展現(xiàn)出了極大的前途[27]。2017年Liao等[28]利用不同的AVV載體分批把Cas9蛋白、分子開(kāi)關(guān)、Klotho和IL-10的向?qū)NA（guide RNA,gRNA)遞送到細(xì)胞內(nèi)，觀察到不僅這些基因表達(dá)的蛋白水平增加，而且還會(huì)改善急性腎損傷發(fā)生后的腎臟功能，該研究為開(kāi)發(fā)針對(duì)急性腎損傷的表觀遺傳療法開(kāi)辟了新途徑。

2.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)在構(gòu)建腎臟疾病模型中的應(yīng)用

2.2.1 常染色體顯性多囊腎病 常染色體顯性多囊腎病（autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD）是一種常見(jiàn)的遺傳性腎臟病，以腎臟體積增大、高血壓和各種腎外并發(fā)癥為主要臨床表現(xiàn)[29]。據(jù)估計(jì)，全球有大約600萬(wàn)ADPKD患者，其中超過(guò)一半的患者會(huì)發(fā)展為終末期腎臟病，并且需要透析或腎移植[30]。然而，目前尚缺乏治療ADPKD的有效藥物。ADPKD藥物的開(kāi)發(fā)依賴于疾病動(dòng)物模型進(jìn)行藥物藥效及藥理篩選。隨著CRISPR/Cas系統(tǒng)的迅速發(fā)展，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建疾病動(dòng)物模型領(lǐng)域，成為研究相應(yīng)疾病的有效策略，為解決臨床問(wèn)題提供了良好的工具。大部分ADPKD主要由PKD1基因突變引起。2019年Tsukiyama等[31]運(yùn)用CRISPR/Cas系統(tǒng)成功構(gòu)建了敲除PKD1基因的恒河猴模型，該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎臟表現(xiàn)為體積增大伴大量囊腫形成，證明敲除PKD1基因可成功模擬ADPKD患者腎臟。2020年Kuraoka等[32]將CRISPR/Cas系統(tǒng)應(yīng)用于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）。研究者敲除人iPSC細(xì)胞中的PKD1基因，并誘導(dǎo)細(xì)胞向腎單位前體細(xì)胞和輸尿管芽分化，同樣成功地構(gòu)建了ADPKD模型。上述模型為闡明ADPKD的發(fā)病機(jī)制，探索有效的治療策略，奠定了良好的基礎(chǔ)。

2.2.2 法布里病 法布里病又稱Anderson-Fabry病，最早由兩位皮膚科醫(yī)生William Anderson和Johannes Fabry報(bào)道，由此得名，是一種罕見(jiàn)的X伴性遺傳的溶酶體貯積病，由編碼α-半乳糖苷酶A（α-galactosidase A,α-Gal A）基因（GLA）突變引起[33]。α-Gal A 能夠催化球形三酰神經(jīng)酰胺（globotriaosylceramide,Gb3）部分水解，因此，α-Gal A的不足會(huì)導(dǎo)致血漿中Gb3和其他鞘糖脂水平升高，并在各種器官組織的細(xì)胞內(nèi)積累，引起一系列臟器病變[34]。2016年P(guān)ereira等[35]將CRISPR/Cas系統(tǒng)應(yīng)用于人永生化足細(xì)胞，GLA敲除細(xì)胞如預(yù)期表現(xiàn)出法布里病生化表型，α-Gal A活性降低，Gb3水平升高，成功構(gòu)建了靶向GLA的人永生化足細(xì)胞法布里病模型。該模型為檢驗(yàn)法布里病發(fā)病機(jī)制假說(shuō)提供了有力的工具。

2.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)在異種腎移植中的應(yīng)用 腎移植是目前治療終末期腎臟病最有效的方法。與維持性血液透析相比，腎移植可顯著提高患者的生活質(zhì)量，降低死亡率[36]。盡管醫(yī)學(xué)取得了較大的進(jìn)步，人們對(duì)器官捐獻(xiàn)和移植的認(rèn)識(shí)也有所提高，但供求之間的差距仍在繼續(xù)擴(kuò)大。據(jù)估計(jì)，在美國(guó)有超過(guò)10萬(wàn)名患者在等待腎移植[37]。異種移植為緩解人體器官捐贈(zèng)長(zhǎng)期短缺的問(wèn)題提供了可能性。豬腎目前被認(rèn)為是臨床移植理想的供體器官來(lái)源。這在很大程度上是因?yàn)樨i腎在大小、結(jié)構(gòu)、腎小球?yàn)V過(guò)率、內(nèi)源性肌酐清除率等主要生理指標(biāo)上與人腎相似[38-39]。然而異種腎移植仍然面臨著一些難題，由于豬的體內(nèi)存在內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（porcine endogenous retroviruses,PERVs），移植動(dòng)物的器官后可能引發(fā)人類出現(xiàn)新的疾病。2015年Yang等[40]利用CRISPR/Cas系統(tǒng)將豬的PERV基因徹底破壞，證明了豬腎用于腎臟異種移植的可能。此外，與人體器官相比，異種器官的移植后免疫排斥反應(yīng)更嚴(yán)重。為了解決這個(gè)難題，2018年Adams等[41]利用CRISPR/Cas技術(shù)敲除豬細(xì)胞分別負(fù)責(zé)α-半乳糖殘基（α-galactosyl residues,α-Gal）和Sda這兩種異種抗原生成酶相關(guān)的基因GGTA1和B4GALNT2，從而克服了超急性排斥反應(yīng)。研究者通過(guò)以野生型豬外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）為對(duì)照，對(duì)GGTA1/B4GALNT2基因敲除的PBMCs進(jìn)行表型分析，發(fā)現(xiàn)GGTA1/B4GALNT2基因敲除的PBMCs完全不含α-Gal和Sda兩種抗原，而對(duì)照組的兩種抗原均呈強(qiáng)陽(yáng)性，說(shuō)明不存在脫靶效應(yīng)。不久前，美國(guó)紐約大學(xué)成功實(shí)施了全球首例轉(zhuǎn)基因豬腎移植人體手術(shù)，且未立即出現(xiàn)排斥反應(yīng)，為解決移植器官短缺問(wèn)題帶來(lái)曙光[42]。

3 展望

本文介紹了CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)、基本原理、分類及其在腎臟疾病研究中的應(yīng)用。最近開(kāi)發(fā)的CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠有效地在各種生物體和細(xì)胞類型中精確修改基因組，現(xiàn)已成為研究包括腎臟在內(nèi)許多系統(tǒng)疾病的有力工具。雖然CRISPR/Cas系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、效率高、特異性強(qiáng)、應(yīng)用多樣等諸多優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一些缺陷，如遞送效率低、脫靶效應(yīng)等。如何恰當(dāng)?shù)貙RISPR傳遞到特定器官以糾正突變，以及如何從基因上設(shè)計(jì)包含適合移植的人體器官的嵌合體需要進(jìn)一步探討。未來(lái)的腎臟疾病研究應(yīng)基于強(qiáng)有力的臨床前數(shù)據(jù)，將這種強(qiáng)大的技術(shù)安全有效地應(yīng)用于確定補(bǔ)充或改進(jìn)現(xiàn)有療法的有效策略。筆者相信技術(shù)進(jìn)步和新應(yīng)用的快速發(fā)展無(wú)疑會(huì)使CRIPSR/Cas系統(tǒng)成為未來(lái)腎臟疾病研究的重要組成部分。