李 川，張盼盼，張美微，牛 軍，趙 霞，何冠華，喬江方

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002；2. 寶豐縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，河南 寶豐 467400）

玉米作為我國重要的糧食、飼料、經(jīng)濟(jì)三合一作物，對保障我國糧食安全具有重要作用[1]。近年來，我國人口增加、社會發(fā)展引起勞動力轉(zhuǎn)移及耕地面積大大減少，提高玉米單位面積產(chǎn)量成為滿足我國對玉米需求的有效途徑[2?3]。合理施肥是提高玉米單產(chǎn)的重要措施，尤其是氮肥，其對玉米單產(chǎn)的貢獻(xiàn)率約為45%[4]。我國氮肥單位面積施用量超過美國等國家，但是當(dāng)季氮肥利用率卻只有30%～35%，低于世界平均水平[5]。過量施用氮肥不僅增加了生產(chǎn)成本、降低了氮肥利用率、浪費資源，還會導(dǎo)致植株細(xì)胞壁變薄、莖稈易折斷和病菌侵襲（如玉米葉枯病大面積暴發(fā)）。另外，過量施用氮肥還會導(dǎo)致土壤酸化板結(jié)、土壤微生物活性下降、水及大氣污染等環(huán)境問題[6]。2020 年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部明確提出化肥施用量零增長的政策[7]。因此，提高玉米單產(chǎn)應(yīng)該通過提高玉米的氮肥利用效率來實現(xiàn)。然而，不同玉米品種對施氮量的響應(yīng)程度不同、氮肥利用效率不同[8?10]。依據(jù)氮素吸收效率和氮素利用效率，玉米氮高效品種可劃分為高氮高效型品種、低氮高效型品種[11?13]、低氮高氮均高效型品種[14?17]。其中，低氮高效型玉米品種可以在低氮條件下實現(xiàn)穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)[18?20]，提高氮肥利用率，減少氮肥施用量[21?22]，減少生產(chǎn)成本，防止環(huán)境污染，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展[23?24]。因此，研究氮高效玉米品種的氮高效機制對減施氮肥、提高單產(chǎn)及培育新的氮高效品種具有重要意義。目前，玉米氮高效品種相關(guān)研究多集中在氮運籌方式[25?27]及氮肥效率篩選標(biāo)準(zhǔn)評定[28?30]方面，尚未見不同氮效率玉米品種響應(yīng)氮肥減施的差異表達(dá)基因（Differently expressed genes，DEG）研究。為此，在正常氮和低氮條件下，對氮高效和氮低效玉米品種灌漿中期穗位葉進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，分析不同氮效率玉米品種中氮代謝相關(guān)DEG，并對重要DEG 進(jìn)行功能富集分類和代謝通路分析，以期闡明不同氮效率品種響應(yīng)氮肥減施的復(fù)雜分子機制，為選育耐低氮玉米品種提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況及試驗材料

試驗于2021 年在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗示范基地（新鄉(xiāng)市原陽縣，113°42′4″E、35°0′17″N）進(jìn)行。該區(qū)屬于暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，土壤類型為潮土，肥力均勻。試驗地前茬作物為小麥，排灌方便。0～30 cm 耕層土壤pH 值為8.4，呈弱堿性，有機質(zhì)含量為17.25 g/kg，全氮含量為0.96 g/kg，速效氮含量為79.35 mg/kg，速效磷含量為39.22 mg/kg，速效鉀含量為170.56 mg/kg。

供試玉米品種為偉科518（WK518）、農(nóng)大108（ND108）。河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所玉米耕作與栽培課題組前期研究［28］結(jié)果表明，WK518在氮肥減施條件下減產(chǎn)較少，氮肥利用效率顯著高于ND108；WK518 氮吸收效率、氮利用效率、氮效率及穗位葉SPAD 值、初始熒光值、最大熒光值、最大光化學(xué)效率、PSⅡ綜合性能指數(shù)、硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶活性均高于ND108。供試氮肥為尿素（含N 46%），磷肥為過磷酸鈣（含P2O512%），鉀肥為硫酸鉀（含K2O 52%）。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置2 個氮水平，分別為0 kg/hm2（低氮，LN）和225 kg/hm2（正常氮，HN）。每個處理3 個重復(fù)，共12 個小區(qū)。每個小區(qū)均為8 行區(qū)，行長為5 m，行間距為0.6 m，小區(qū)間隔為1.2 m。氮肥50%基施、50%于大喇叭口期追施。磷肥和鉀肥的施用量均為120 kg/hm2，作為基肥施用。WK518 和ND108 均于2021 年6 月12 日播種，種植密度均為67 500株/hm2。其他田間管理與大田生產(chǎn)一致。

1.3 取樣

于灌漿中期（2021 年8 月26 日），用酒精消毒后的剪刀剪取長勢一致的5 株玉米的部分穗位葉，混合后放入5 mL 離心管中，重復(fù)3 次，分別命名為WK518-LN-1、 WK518-LN-2、 WK518-LN-3、WK518-HN-1、 WK518-HN-2、 WK518-HN-3、ND108-LN-1、ND108-LN-2、ND108-LN-3、ND108-HN-1、ND108-HN-2、ND108-HN-3，立即放入液氮罐中暫時保存，帶回實驗室后于-80 ℃超低溫冰箱中長期保存。

1.4 轉(zhuǎn)錄組高通量測序

玉米葉片總RNA 用RNeasy plant mini kit（Qiagen，Germany）試劑盒提取，總RNA 的完整性用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗，總RNA 的質(zhì)量用Agilent Bioanalyzer 2100 system（Aglilent Technologies，USA）生物芯片分析檢測儀進(jìn)行檢測，總RNA 的濃度用Nanodrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer（Nanodrop Technologie，USA）儀器定量檢測。將沒有降解且濃度較高的總RNA 樣本送至測序公司。利用Oligo（dT）富集分離出mRNA，并將完整的mRNA 隨機斷裂成300 bp 的mRNA 片段，之后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建cDNA 文庫，連接接頭之后進(jìn)行PCR 擴增，最后利用Illumina HiSeqTM2500 測序儀進(jìn)行高通量測序。

1.5 轉(zhuǎn)錄組豐度分析

測序原始數(shù)據(jù)通過堿基分布統(tǒng)計進(jìn)行質(zhì)量控制，過濾去除接頭和低質(zhì)量序列之后得到干凈序列。利用Hisat2序列比對軟件將測序所得的干凈序列與參考基因組玉米自交系B73 基因組（https://www.maizegdb.org/）進(jìn)行比對，統(tǒng)計比對結(jié)果。轉(zhuǎn)錄本豐度等同于基因表達(dá)量分析，基因表達(dá)水平越高轉(zhuǎn)錄本豐度越高?；虮磉_(dá)水平用比對到參考基因組中的序列的數(shù)量來計算，即R（F）PKM（Reads/fragments per kilobase of exon model per million mapped reads）值，每100 萬條序列中每個基因以1 000 個堿基為單位，與參照基因組公布序列比對上的序列數(shù)量。

1.6 DEG分析

不同樣本之間DEG 的篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2（差異倍數(shù)）|≥1 且達(dá)到顯著水平（P<0.05）。然后參照GO（Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫將篩選出的DEG 的功能進(jìn)行分類，參照KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫對DEG 編碼蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行預(yù)測及代謝通路富集分析。

1.7 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

根據(jù)高通量測序結(jié)果篩選出9個與氮吸收效率相關(guān)的DEG，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物序列，交生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。qRT-PCR 反應(yīng)體系按照Trans Start Top Green qPCR SuperMix 試劑盒進(jìn)行配制，反應(yīng)程序：95 ℃10 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，循環(huán)40 次。根據(jù)2-△△CT法計算基因的相對表達(dá)量。試驗設(shè)3 個生物學(xué)重復(fù)、3個技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮水平處理玉米穗位葉轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量分析

對12 個不同氮水平處理玉米穗位葉樣本高通量轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果（表1）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)干凈序列豐度較高，GC 含量為48.50%以上，堿基質(zhì)量值（Q20）在99.16%以上；與參考基因組公布序列進(jìn)行比對，匹配率為84.00%～89.89%，比對有效。基因功能分析之后共獲得49 339個基因。

表1 不同氮條件下不同氮效率玉米品種穗位葉轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量Tab.1 The transcriptome sequencing quality of ear leaves of maize varieties with different nitrogen efficiencies under different nitrogen levels

2.2 低氮條件下不同氮效率玉米品種DEG分析

由圖1 可知，低氮條件下，在對比組WK518-LN vs ND108-LN 中共檢測到4 384 個DEG。其中，2 065個為上調(diào)表達(dá)基因，2 319個為下調(diào)表達(dá)基因。

圖1 不同氮條件下不同氮效率玉米品種中DEG數(shù)目Fig.1 The DEG numbers of different maize varieties with different nitrogen efficiencies under different nitrogen levels

由圖2 可知，WK518-LN vs ND108-LN 對比組中DEG 顯著富集的GO條目為尿卟啉-ⅢC-甲基轉(zhuǎn)移 酶 活 性（Uroporphyrin?Ⅲ C?methyltransferase activity）、甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶活性（Mannose?6?phosphate isomerase activity）、氧 化- 還 原 過 程（Oxidation?reduction process）、線 粒 體 組 織（Mitochondrion organization）、核 染 色 質(zhì)（Nuclear chromatin）、ATP 結(jié) 合（ATP binding）、葉 綠 體（Chloroplast）、尿 卟 啉 原 脫 羧 酶 活 性（Uroporphyrinogen decarboxylase activity）、細(xì)胞質(zhì)小核糖體亞單位（Cytosolic small ribosomal subunit）、U2 核內(nèi)小RNA 結(jié)合（U2 snRNA binding）、順式-反式異構(gòu)酶活性（Cis?trans isomerase activity）、槲皮素7-O-葡糖轉(zhuǎn)移酶（Quercetin 7?O?glucosyltransferase activity）、槲皮素3-O-葡糖轉(zhuǎn)移酶（Quercetin 3?O?glucosyltransferase activity）、類黃酮葡萄糖醛酸化（Flavonoid glucuronidation）、類黃酮生物合成過程（Flavonoid biosynthetic process）、皮質(zhì)微管（Cortical microtubule）、微 管（Microtubule）、高 溫 響 應(yīng)（Response to heat）、原生質(zhì)膜（Plasma membrane）、ADP 結(jié)合（ADP binding）。其中，富集程度最高的為尿卟啉-ⅢC-甲基轉(zhuǎn)移酶活性、甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶活性2 個GO 條目；富集最多DEG 的為原生質(zhì)膜、葉綠素、ATP結(jié)合3個GO條目。

圖2 低氮條件下WK518-LN vs ND108-LN對比組中DEG的GO富集分析Fig.2 GO enrichment analysis of DEGs in WK518-LN vs ND108-LN group under low nitrogen level

通過KEGG 數(shù)據(jù)庫對低氮條件下WK518-LN vs ND108-LN 對比組中DEG 的代謝通路進(jìn)行分析（圖3），發(fā)現(xiàn)WK518-LN vs ND108-LN 對比組中DEG 富集于氨基糖及核苷酸糖新陳代謝（Amino sugar and nucleotide sugar metabolism），苯丙氨酸新陳代謝（Phenylalanine metabolism），類單萜生物合成（Monoterpenoid biosynthesis），甘氨酸、絲氨酸及蘇氨 酸 新 陳 代 謝（Glycine，serine and threonine metabolism），堿基剪切修復(fù)（Base excision repair），錯配修復(fù)（Mismatch repair），類胡蘿卜素生物合成（Carotenoid biosynthesis），花 青 素 生 物 合 成（Anthocyanin biosynthesis），磷酸鹽及亞磷酸鹽新陳代謝（Phosphonate and phosphinate metabolism），丁酸甲酯新陳代謝（Butanoate metabolism），過氧化物酶體（Peroxisome），靈菌紅素生物合成（Prodigiosin biosyntheses），非同源性末端連接（Non?homologous end?joining），DAN 復(fù)制（DNA replication），丙氨酸新陳代謝（α?alanine metabolism），泛醌及其他萜類-醌化合物生物合成（Ubiquinone and other terpenoid?quinone biosynthesis），卟啉及葉綠素新陳代謝（Porphyrin and chlorophyll metabolism），?；撬峒皝喤；撬嵝玛惔x（Taurine and hypotaurine metabolism），纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸降解（Valine，leucine and isoleucine degradation），核苷酸剪切修復(fù)（Nucleotide excision repair）20 個KEGG 代謝通路。

圖3 低氮條件下WK518-LN vs ND108-LN對比組中DEG的KEGG分類Fig.3 KEGG classification of DEGs in WK518-LN vs ND108-LN group under low nitrogen level

2.3 正常氮條件下不同氮效率玉米品種DEG分析

由圖1 可見，正常氮條件下，在WK518-HN vs ND108-HN 對比組中共檢測到6 184 個DEG。其中，2 368個為上調(diào)表達(dá)基因，3 780個為下調(diào)表達(dá)基因。檢測到的DEG 遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于低氮條件，尤其是下調(diào)表達(dá)基因比低氮條件下多了63%。

由圖4 可知，WK518-HN vs ND108-HN 對比組中DEG 顯著富集于氣孔關(guān)閉（Stomatal closure）、跨膜受體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性（Transmembrane receptor protein serine/threonine kinase activity）、葉綠體基質(zhì)（Chloroplast stroma）、類囊 體（Thylakoid）、葉 綠 體 被 膜（Chloroplast envelope）、防御響應(yīng)（Defense response）、蛋白質(zhì)自磷酸化（Protein autophosphorylation）、未折疊蛋白結(jié)合（Unfolded protein binding）、氧 化- 還 原 過 程（Oxidation?reduction process）、跨膜受體酪氨酸蛋白激酶活性（Transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity）、高溫響應(yīng)（Response to heat）、NAD（P）H脫氫酶復(fù)合體/質(zhì)體醌[NAD（P）H dehydrogenase complex/plastoquinone]、寒 冷 響 應(yīng)（Response to cold）、ATP 結(jié) 合（ATP binding）、蛋 白 質(zhì) 磷 酸 化（Protein phosphorylation）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性（Protein serine/threonine kinase activity）、葉綠體類囊體膜（Chloroplast thylakoid membrane）、膜組成部分（Integral component of membrane）、葉綠體（Chloroplast）、原生質(zhì)膜（Plasma membrane）等GO 條目。其中，富集程度較高的為NAD（P）H 脫氫酶復(fù)合體/質(zhì)體醌、跨膜受體酪氨酸蛋白激酶活性2 個GO 條目；富集最多DEG 的為原生質(zhì)膜、葉綠體、膜組成部分3個GO條目。

圖4 正常氮條件下WK518-HN vs ND108-HN對比組中DEG的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of DEGs in WK518-HN vs ND108-HN group under normal nitrogen level

由圖5 可知，WK518-HN vs ND108-HN 對比組中DEG 顯著富集于光合作用生物體中碳固定（Carbon fixation in photosynthetic organisms），氨基糖及核苷酸糖新陳代謝（Amino sugar and nucleotide sugar metabolism），糖 酵 解/糖 異 生（Glycolysis/gluconeogenesis），丙 氨 酸 新 陳 代 謝（β?alanine metabolism），光合作用-天線蛋白（Photosynthesis?antenna proteins），丙氨酸、天冬氨酸及谷氨酸新陳代謝（Alanine，aspartate and glutamate metabolism），賴氨酸降解（Lysine degradation），苯丙氨酸新陳代謝（Phenylalanine metabolism），果糖及甘露糖新陳代謝（Fructose and mannose metabolism），光合作用（Photosynthesis），泛醌及其他萜類-醌化合物生物合 成（Ubiquinone and other terpenoid?quinone biosynthesis），過氧化物酶體（Peroxisome），植物-病原體相互作用（Plant?pathogen interaction），精氨酸及脯氨酸新陳代謝（Arginine and proline metabolism），甘氨酸、絲氨酸及蘇氨酸新陳代謝（Glycine，serine and threonine metabolism），淀粉及蔗糖新陳代謝（Starch and sucrose metabolism），磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)（Phosphatidylinositol signaling system），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)加工過程（Protein processing in endoplasmic reticulum），花生四烯酸新陳代謝（Arachidonic acid metabolism），氮新陳代謝（Nitrogen metabolism）20 個KEGG 代謝通路。與低氮條件下WK518-LN vs ND108-LN 對比組相比，只有6 個共同的顯著富集代謝通路，分別為氨基糖及核苷酸糖新陳代謝，丙氨酸新陳代謝，苯丙氨酸新陳代謝，泛醌及其他萜類-醌化合物生物合成，過氧化物酶體，甘氨酸、絲氨酸及蘇氨酸新陳代謝。

圖5 正常氮條件下WK518-HN vs ND108-HN對比組中DEG的KEGG分類Fig.5 KEGG classification of DEGs in WK518-HN vs ND108-HN group under normal nitrogen level

2.4 WK518在不同氮條件下DEG分析

由圖1 可見，在不同氮條件下，在WK518-HN vs WK518-LN 對比組中共檢測到3 277 個DEG。其中，1 009 個為上調(diào)表達(dá)基因，2 268 個為下調(diào)表達(dá)基因。

由圖6 可知，WK518-HN vs WK518-LN 對比組中DEG 顯著富集的GO 條目為幾丁質(zhì)響應(yīng)（Response to chitin）、蛋 白 質(zhì) 磷 酸 化（Protein phosphorylation）、膜（Membrane）、吲哚硫代葡萄糖苷代謝過程（Indole glucosinolate metabolic process）、肌醇半乳糖苷-蔗糖半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（Galactinol?sucrose galactosyltransferase）、高 溫 脅 迫 響 應(yīng)（Response to heat）、原生質(zhì)膜（Plasma membrane）、干旱脅迫響應(yīng)（Response to water deprivation）、冷脅迫響應(yīng)（Response to cold）、脫落酸激活的信號通路（Abscisic acid?activated signaling pathway）、膜組成部分（Integral component of membrane）、脫落酸響應(yīng)（Response to abscisic acid）、鹽脅迫響應(yīng)（Response to salt stress）、幾丁質(zhì)酶活性（Chitinase activity）、鈣離 子 結(jié) 合（Calcium ion binding）、病 原 體 響 應(yīng)（Response to virus）、棉籽糖分解代謝過程（Raffinose catabolic process）、棉籽糖α-半乳糖苷酶活性（Raffinose alpha?galactosidase activity）、對其他生物體的防御反應(yīng)（Defense response to other organism）、丁烯內(nèi)酯衍生物響應(yīng)（Response to karrikin）。其中，富集程度較高的GO條目為棉籽糖分解代謝過程、棉籽糖α-半乳糖苷酶活性；富集較多DEG的GO條目為原生質(zhì)膜、膜組成部分。

圖6 WK518在不同氮水平下DEG的GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of DEGs in WK518-HN vs WK518-LN group under different nitrogen levels

由圖7 可知，WK518-HN vs WK518-LN 對比組中DEG 顯著富集于光合作用生物體中碳固定（Carbon fixation in photosynthetic organition），植物激素信號傳導(dǎo)（Plant hormone signal transduction），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)加工過程（Protein processing in endoplasmic reticulum），植物-病原體相互作用（Plant?pathogen interaction），植物MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway?plant），類胡蘿卜素生物合成（Carotenoid biosynthesis），果糖及甘露糖新陳代謝（Fructose and mannose metabolism），乙醛酸及二羧酸鹽新陳代謝（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism） ，糖 酵 解/糖 異 生（Glycolysis/gluconeogenesis），類 黃 酮 生 物 合 成（Flavonoid biosynthesis），玉 米 素 生 物 合 成（Zeatin biosynthesis），其他類型O-聚糖生物合成（Other types of O?glycan biosynthesis），精氨酸及脯氨酸新陳代謝（Arginine and proline metabolism），氨基糖及核苷酸糖新陳代謝（Amino sugar and nucleotide sugar metaboism），芪類、雙苯庚烷及姜辣素（Stilbenoid，diarylheptanoid and gingerol），光合作用（Photosynthesis），植物晝夜節(jié)奏（Circadian rhythm?plant），甘油磷 脂新陳 代謝（Glycerophospholipid metabolism），淀粉及蔗糖新陳代謝（Starch and sucrose metabolism），苯丙氨酸新陳代謝（Phenylalanine metabolism）共20個KEGG代謝通路。

圖7 WK518在不同氮條件下DEG的KEGG分類Fig.7 KEGG classification of DEGs in WK518-HN vs WK108-LN group under different nitrogen levels

2.5 ND108在不同氮條件下DEG分析

由圖1 可見，在不同氮條件下，在ND108-HN vs ND108-LN 對比組中共檢測到874 個DEG。其中，364個為上調(diào)表達(dá)基因，510個為下調(diào)表達(dá)基因。檢測到的DEG 遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于不同氮條件下的WK518，尤其是下調(diào)表達(dá)基因比WK518少了77.52%。

由圖8 可知，ND108-HN vs ND108-LN 對比組中DEG 顯著富集的GO 條目主要為干旱脅迫響應(yīng)（Response to water deprivation）、毒素分解代謝過程（Toxin catabolic process）、幾丁質(zhì)酶活性（Chitinase activity）、海藻糖生物合成過程（Trehalose biosynthetic process）、海 藻 糖- 磷 酸 酶 活 性（Trehalose?phosphatase activity）、幾丁質(zhì)結(jié)合（Chitin binding）、作用于配對的氧化還原酶活性（Oxidoreductase activity，acting on paired）、調(diào)控絲氨酸/蘇 氨 酸 蛋 白（Regulation of protein serine/threonine protein）、蛋白磷酸酶抑制劑活性（Protein phosphatase inhibitor activity）、氧 化 還 原 過 程（Oxidation?reduction process）、鎘 離 子 響 應(yīng)（Response to cadmium ion）、脫落酸結(jié)合（Abscisic acid binding）、類黃酮生物合成過程（Flavonoid biosynthetic process）、類黃酮糖脂化作用（Flavonoid glucuronidation）、脫落酸激活的信號通路（Abscisic acid?activated signaling pathway）、砷酸鹽還原酶/谷氧還蛋白活性（Arsenate reductase/glutaredoxin activity）、脫落酸響應(yīng)（Response to abscisic acid）、次級代謝物生物合成過程（Secondary metabolite biosynthetic process） 、 信 號 傳 導(dǎo)（Signal transduction）、食 草 動 物 響 應(yīng)（Response to herbivore）。其中，富集程度較高的GO 條目為食草動物響應(yīng)、砷酸鹽還原酶/谷氧還蛋白活性；富集最多DEG 的GO 條目為氧化還原過程、鎘離子響應(yīng)、干旱脅迫響應(yīng)。與不同氮條件下WK518 相比，只有3個相同的顯著富集GO 條目，即干旱脅迫響應(yīng)、脫落酸激活的信號通路、脫落酸響應(yīng)?？梢姷咝贩NWK518 與氮低效品種ND108 響應(yīng)氮肥減施的分子機制有著巨大的差異。

圖8 ND108在不同氮條件下DEG的GO富集分析Fig.8 GO enrichment analysis of DEGs in ND108-HN vs ND108-LN group under different nitrogen levels

由圖9 可知，在不同氮條件下，ND108-HN vs ND108-LN 對比組中DEG 富集的KEGG代謝通路為乙醛酸及二羧酸鹽新陳代謝（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism），植 物MAPK 信 號 通 路（MAPK signaling pathway?plant），靈菌素生物合成（Prodigiosin biosynthesis），玉米素生物合成（Zeatin biosynthesis），生物素新陳代謝（Biotin metabolism），雙萜類生物合成（Diterpenoid biosynthesis），黃酮及黃酮醇生物合成（Flavone and flavonol biosynthesis），α-亞麻酸新陳代謝（α?linolenic acid metabolism），氮代謝（Nitrogen metabolism），淀粉及蔗糖新陳代謝（Starch and sucrose metabolism），苯丙素生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis），ABC 轉(zhuǎn)運蛋白（ABC transporters），精 氨 酸 生 物 合 成（Arginine biosynthesis），植物激素信號傳導(dǎo)（Plant hormone signal transduction），C5 分 支 二 元 酸 新 陳 代 謝（C5?branched dibasic acid metabolism），脂肪酸生物合成（Fatty acid biosynthesis），類黃酮生物合成（Flavonoid biosynthesis），?；撬峒皝喤；撬嵝玛惔x（Taurine and hypotaurine metabolism），泛酸及輔酶A 生物合成（Pantothenate and CoA biosynthesis），丙氨酸、天冬氨酸及谷氨酸新陳代謝（Alanine，aspartate and glutamate metabolism）。與不同氮條件下WK518 相比，僅有5 個相同的代謝通路，分別為乙醛酸及二羧酸鹽新陳代謝、植物MAPK 信號通路、玉米素生物合成、淀粉及蔗糖新陳代謝、植物激素信號傳導(dǎo)。

圖9 ND108在不同氮條件下DEG的KEGG分類Fig.9 KEGG classification of DEGs in ND108-HN vs ND108-LN group under different nitrogen levels

2.6 不同氮條件下不同氮效率玉米品種中的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子分析

不同氮條件下，在氮高效品種WK518和氮低效品種ND108 檢測到的DEG 中，共有58 個轉(zhuǎn)錄因子家族（表2），這些轉(zhuǎn)錄因子大多調(diào)控植物生長發(fā)育、生物及非生物脅迫響應(yīng)等。其中，GRAS 轉(zhuǎn)錄因子家族、bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族、MYB 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族、NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族、C3H 轉(zhuǎn)錄因子家族、ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族、C2H2轉(zhuǎn)錄因子家族、WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族、FAR1 轉(zhuǎn)錄因子家族均包含了1 000 個以上的DEG；B3、bZIP、MYB、G2-like、M-type-MADS、Trihelix、GATA、HB-other、LBD、ARF、TCP、HDZIP、E2F/DP、MIKC-MADS、Nin-like、Dof、SBP、GeBP、HSF、NF-YA、ZF-HD、AP2、CAMTA、NF-YC、NF-YB、CPP、BES1、DBB、ARR-B、TALE、YABBY、CO-like、STAT 33 個轉(zhuǎn)錄因子家族均包含了100 個以上的DEG。

表2 不同氮條件下WK518和ND108中的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Tab.2 Differentially expressed transcription factors in WK518 and ND108 under different nitrogen levels

續(xù)表2 不同氮條件下WK518和ND108中的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Tab.2（Continued） Differentially expressed transcription factors in WK518 and ND108 under different nitrogen levels

2.7 不同氮條件下不同氮效率玉米品種中部分DEG的表達(dá)驗證

為了驗證不同氮效率品種中氮吸收相關(guān)DEG的表達(dá)模式，利用qRT-PCR 分析正常氮條件下LOC109944516-1、LOC109944516-2、LOC103640123、LOC103636214 及低氮條件下LOC100279186-1、LOC100279186-2、LOC103640667、LOC103641949、LOC100217128 在不同氮效率品種WK518、ND108中的表達(dá)情況。由圖10 可知，在正常氮條件下，LOC109944516-1、LOC109944516-2、OC103640123、LOC103636214在氮高效品種WK518中的表達(dá)量下降。其 中，LOC109944516-1、LOC109944516-2、LOC103640123 達(dá)到顯著水平，這與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。 在低氮條件下，LOC100279186-1、LOC100279186-2、LOC103641949、LOC100217128在氮高效品種WK518中的表達(dá)量顯著升高，這與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。

圖10 不同氮條件下WK518和ND108中部分DEG的表達(dá)驗證Fig.10 Expression validation of partial DEGs in WK158 and ND108 under different nitrogen levels

3 結(jié)論與討論

在WK518-HN vs WK518-LN 對比組中篩選到DEG 3 277 個，然而在ND108-HN vs ND108-LD 對比組中僅僅篩選到874 個DEG，這與張盼盼等［28］的氮肥減施條件下不同基因型玉米氮效率差異及生理特性研究結(jié)果一致。正是WK518 在低氮條件下啟動了更多的基因差異表達(dá)，從而在表型上表現(xiàn)為氮肥減施條件下依舊有著較高的葉綠素含量、氮素代謝相關(guān)酶活性和較優(yōu)的葉綠素?zé)晒馓匦?，從而保證了WK518 在不施氮肥的條件下籽粒干物質(zhì)積累和氮素同化能力，維持較高的氮素利用效率，最終保障產(chǎn)量。而ND108 在低氮條件下由于啟動了較少的基因差異表達(dá)，不能維持正常的葉綠素含量、氮素代謝相關(guān)酶活性、熒光特性等，最終表現(xiàn)為減產(chǎn)嚴(yán)重。

本研究共檢測到58個差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子家族，這些轉(zhuǎn)錄因子家族成員大多調(diào)控植物生長發(fā)育、生物及非生物脅迫響應(yīng)等，主要包括bHLH 轉(zhuǎn)錄因子、MYB相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、NAC轉(zhuǎn)錄因子、FAR1轉(zhuǎn)錄因子等。玉米植株響應(yīng)低氮的分子機制是多基因的綜合作用，下一步可以針對性選擇幾類重要的氮肥響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，對其進(jìn)行功能驗證，最終鑒定出重要的氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因，并通過分子生物學(xué)技術(shù)提高玉米植株的氮吸收效率。