戰(zhàn) 磊，王 寒，關羅浩，張蒙蒙，梁俊陽，張曉瑞，付 博，王玉勝

（1. 廣東中煙工業(yè)有限責任公司 技術中心，廣東 廣州 510385；2. 河南農業(yè)大學 煙草學院，河南 鄭州 450002）

煙葉是卷煙工業(yè)的基礎，其品質的優(yōu)劣對卷煙品質起著舉足輕重的作用[1]。煙葉的內在化學成分是煙葉品質形成的物質基礎，也是煙葉品質優(yōu)劣的關鍵因素[2]。我國烤煙普遍存在淀粉含量過高、內在化學成分不協(xié)調等問題，導致工業(yè)可用性降低。淀粉作為煙葉中的大分子化合物對煙葉品質有著重要的影響[3]。煙葉通過調制后，部分淀粉會降解而轉化為糖。目前，國內烤煙烤后淀粉殘留量較高，這些化合物對卷煙吸食品質有不良影響，使得煙葉在卷煙生產中的應用受到了較大限制[4]。在一定范圍內，煙葉感官質量隨淀粉含量的下降而提升。

近年來，利用微生物發(fā)酵降低煙葉中的淀粉含量已成為提高煙葉品質研究的熱點[5]。覃明娟等[6]研究表明，植物乳桿菌能顯著改善煙葉品質及煙葉香吃味。馮穎杰等[7]發(fā)現(xiàn)1 株高產淀粉酶的蘇云金芽孢桿菌，該菌能在生長和代謝過程中產生淀粉酶，將煙葉中的淀粉降解為還原糖。還原糖裂解有利于平衡煙氣酸堿性、協(xié)調香氣[8?9]。在煙葉發(fā)酵過程中，提高產酶菌株的淀粉酶活性可提高淀粉的降解效率，提升煙葉品質并縮短反應時間[10]。不同菌株的產酶能力又受到營養(yǎng)成分和發(fā)酵條件的影響[11?12]。因此，對菌株的培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，能最大限度地提升菌株的產酶能力[13]。在以往菌株產酶優(yōu)化研究中多采用正交試驗[14]，而Box-Benhnken 設計結合響應面分析法較正交試驗法簡便易行，且結果真實可靠。筆者所在課題組前期研究得到1 株產淀粉酶蘇云金芽孢桿菌，能夠顯著提升高淀粉含量煙葉的品質，為了實現(xiàn)研究成果應用，以淀粉酶活性為指標，結合單因素試驗和Box-Benhnken 響應面試驗優(yōu)化蘇云金芽孢桿菌產淀粉酶的最佳工藝，并將優(yōu)化后的粗酶液應用于煙葉發(fā)酵進行效果驗證，以期為產淀粉酶蘇云金芽孢桿菌的工業(yè)化應用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

菌株：蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）SY-1 菌株（以下簡稱SY-1 菌株），由河南農業(yè)大學煙草加工實驗室分離和篩選。

煙葉：煙葉樣品由廣東中煙工業(yè)有限責任公司提供，選用淀粉含量最高的原料作為試驗樣品。煙葉化學成分含量：淀粉8.53%、總糖30.48%、還原糖24.76%、煙堿2.27%、總氮1.90%。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 3 g/L，pH值為7.0，高壓滅菌。

產酶培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 3 g/L，pH值為7.0，高壓滅菌。

1.2 試驗方法

1.2.1 SY-1 菌株粗酶液的獲取 將活化后的蘇云金芽孢桿菌SY-1 接種至產酶培養(yǎng)基中，在35 ℃條件下，160 r/min 發(fā)酵培養(yǎng)24 h，將發(fā)酵液在4 ℃條件下、8 000 r/min 離心10 min。參考陳蕊等[15]的方法制備粗酶液，酶活性檢測方法參考文獻[16]中的方法。

1.2.2 SY-1菌株產酶單因素試驗

1.2.2.1 碳源對SY-1 菌株產淀粉酶的影響 在產酶培養(yǎng)基的基礎上分別以10 g/L 葡萄糖、10 g/L 蔗糖、10 g/L 玉米淀粉、10 g/L 可溶性淀粉、10 g/L 可溶性淀粉+玉米淀粉混合物（m可溶性淀粉∶m玉米淀粉=1∶1，下同）為碳源，研究培養(yǎng)基最佳碳源組成；為考察碳源質量濃度，設置質量濃度分別為5、10、15、20、25 g/L。發(fā)酵條件：35 ℃、160 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)24 h。

1.2.2.2 氮源對SY-1 菌株產淀粉酶的影響 在產酶培養(yǎng)基的基礎上以10 g/L 蛋白胨、10 g/L NH4NO3、10 g/L 酵母粉、10 g/L 尿素、10 g/L 蛋白胨+酵母粉混合物（m蛋白胨∶m酵母粉=1∶1，下同）為氮源，以酶活性為指標，得到最佳氮源；設置最佳氮源的質量濃度分別為5、10、15、20、25 g/L。發(fā)酵條件同1.2.2.1。

1.2.2.3 無機鹽對SY-1 菌株產淀粉酶的影響 在產酶培養(yǎng)基的基礎上分別以3 g/L NaCl、3 g/L CaCl2、3 g/L KNO3、3 g/L MgSO4、3 g/L MnSO4作為無機鹽，以酶活性為指標，得到最佳無機鹽；設置最佳無機鹽的質量濃度分別為1、5、9、13、17 g/L，發(fā)酵條件同1.2.2.1。

1.2.2.4 培養(yǎng)溫度對SY-1 菌株產淀粉酶的影響

可溶性淀粉+玉米淀粉15 g/L 為碳源，蛋白胨+酵母粉20 g/L 為氮源，CaCl2為5 g/L，設置發(fā)酵培養(yǎng)溫度分別為25、30、35、40 ℃，160 r/min 培養(yǎng)24 h，測定菌株酶活性。

1.2.2.5 轉速對SY-1 菌株產淀粉酶的影響 以可溶性淀粉+玉米淀粉15 g/L 為碳源，蛋白胨+酵母粉20 g/L 為氮源，CaCl2為5 g/L，設置轉速分別為140、160、180、200、220 r/min，35 ℃培養(yǎng)24 h，測定菌株酶活性。

1.2.3 SY-1 菌株產酶響應面試驗 采用Design Expert 11 軟件對菌株產酶條件進行響應面試驗設計，在單因素試驗的基礎上，對可溶性淀粉+玉米淀粉、蛋白胨+酵母粉、CaCl2、培養(yǎng)溫度、轉速等因素各設計3個水平（表1）。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.2.4 粗酶液降解煙葉淀粉的作用效果分析 煙葉原料經回潮、切絲后，將菌株SY-1 產酶條件優(yōu)化前及優(yōu)化后的粗酶液均勻噴施于煙絲表面，以噴施同等比例蒸餾水為對照，并分別調整煙絲含水率至18%，于恒溫恒濕箱中35 ℃發(fā)酵48 h。發(fā)酵后煙絲于80 ℃烘箱中干燥5 min，對菌株粗酶液進行滅活。

1.2.5 煙葉中化學成分測定 煙葉中淀粉含量采用《煙草及煙草制品淀粉的測定連續(xù)流動法》（YC/T 216—2013）中的方法測定，常規(guī)化學成分含量分別采用《煙草及煙草制品水溶性糖的測定連續(xù)流動法》（YC/T 159—2002）、《煙草及煙草制品總植物堿的測定 連續(xù)流動法》（YC/T 160—2002）和《煙草及煙草制品總氮的測定 連續(xù)流動法》（YC/T 161—2002）等方法進行測定。煙葉淀粉降解率=（對照煙葉中淀粉含量-處理后煙葉中淀粉含量）/對照煙葉中淀粉含量×100%。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 所有處理均重復測試3 次，采用Design Expert 11、SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，并用Origin 2019軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 SY-1菌株產酶條件單因素試驗結果

2.1.1 碳源對SY-1菌株淀粉酶活性的影響 由圖1可知，以可溶性淀粉、玉米淀粉為碳源時，SY-1菌株淀粉酶活性均高于蔗糖和葡萄糖；相較于單一淀粉，SY-1 菌株以可溶性淀粉+玉米淀粉為碳源時，菌株淀粉酶活性更高。因此，選擇可溶性淀粉+玉米淀粉為SY-1菌株的最適碳源。

圖1 碳源種類對SY-1菌株淀粉酶活性的影響Fig.1 Effects of carbon source species on amylase activity of SY-1 strain

隨著混合淀粉質量濃度的增加，SY-1菌株淀粉酶活性先升高后降低，當可溶性淀粉+玉米淀粉質量濃度為15 g/L 時酶活性最高（圖2）。因此，選擇15 g/L 可溶性淀粉+玉米淀粉為發(fā)酵培養(yǎng)基最適碳源添加量。

圖2 可溶性淀粉+玉米淀粉質量濃度對SY-1菌株淀粉酶活性的影響Fig.2 Effects of soluble starch+corn starch concentration on amylase activity of SY-1 strain

2.1.2 氮源對SY-1菌株淀粉酶活性的影響 由圖3

圖3 氮源種類對SY-1菌株淀粉酶活性的影響Fig.3 Effects of nitrogen source species on amylase activity of SY-1 strain

可知，有機氮源的酶活性明顯高于無機氮源。相較于尿素、硝酸銨，以蛋白胨、酵母粉作為氮源時，SY-1 菌株淀粉酶活性較高，其中以蛋白胨+酵母粉作為混合氮源時，酶活性最高。因此，選擇蛋白胨+酵母粉為最適氮源。

蛋白胨+酵母粉質量濃度在一定范圍內可促進SY-1 菌株淀粉酶的產生，質量濃度為15 g/L 時，酶活性最高（圖4）。

圖4 蛋白胨+酵母粉質量濃度對SY-1菌株淀粉酶活性的影響Fig.4 Effects of peptone+yeast powder concentration on amylase activity of SY-1 strain

2.1.3 無機鹽對SY-1 菌株淀粉酶活性的影響 相較于NaCl、KNO3、MgSO4、MnSO4，CaCl2作為無機鹽時酶活性最高（圖5）。當CaCl2質量濃度為5 g/L時，SY-1菌株淀粉酶活性最高（圖6）。

圖5 無機鹽種類對SY-1菌株淀粉酶活性的影響Fig.5 Effects of inorganic salt species on amylase activity of SY-1 strain

圖6 CaCl2質量濃度對SY-1菌株淀粉酶活性的影響Fig.6 Effects of CaCl2 concentration on amylase activity of SY-1 strain

2.1.4 培養(yǎng)溫度和轉速對SY-1 菌株淀粉酶活性的影響 隨著培養(yǎng)溫度的升高，SY-1菌株淀粉酶活性逐漸增加，在35 ℃時，SY-1 菌株淀粉酶活性最高；在35～40 ℃時，隨著溫度的升高SY-1菌株淀粉酶活性呈現(xiàn)下降趨勢（圖7）。溫度過高時，蛋白質結構容易發(fā)生改變或變性，使酶活性降低[17]。轉速對酶活性有較大的影響，SY-1菌株淀粉酶活性隨著轉速增加先增大后減小，最適轉速為180 r/min（圖8）。

圖7 培養(yǎng)溫度對SY-1菌株淀粉酶活性的影響Fig.7 Effects of culture temperature on amylase activity of SY-1 strain

圖8 轉速對SY-1菌株淀粉酶活性的影響Fig.8 Effects of rotation speed on amylase activity of SY-1 strain

2.2 SY-1菌株產酶條件響應面優(yōu)化試驗結果

2.2.1 回歸方程建立 利用Design Expert軟件分析響應面試驗數(shù)據(jù)，建立多元回歸模型，擬合得到回歸方程：

其中，Y為菌株淀粉酶活性，A、B、C、D和E分別為可溶性淀粉+玉米淀粉質量濃度、蛋白胨+酵母粉質量濃度、CaCl2質量濃度、培養(yǎng)溫度和轉速。

方差分析（表2）表明，模型F=56.29，P<0.000 1，表明回歸模型擬合度高。R2為0.978 3，表明回歸方程與對應的響應值的吻合程度能達到97.83%。R2Pred=0.957 0 和R2Adj=0.960 9 均接近于1。因此，可以用該回歸方程對SY-1 菌株產酶條件的評價指標進行預測。

表2 回歸模型方差分析結果Tab.2 Analysis of variance of regression model

2.2.2 各因素之間的交互作用 三維響應面分析結果顯示（圖9），隨著可溶性淀粉+玉米淀粉質量濃度和蛋白胨+酵母粉質量濃度的增加，菌株淀粉酶活性逐漸增加，但是均存在峰值。可溶性淀粉+玉米淀粉質量濃度對響應值的影響較蛋白胨+酵母粉質量濃度影響更顯著。另外，兩因素的交互作用較強。CaCl2質量濃度與淀粉酶活性呈正相關，但是其對菌株淀粉酶活性的影響弱于可溶性淀粉+玉米淀粉?？扇苄缘矸?玉米淀粉質量濃度與培養(yǎng)溫度兩因素的交互作用較強，影響顯著。轉速與淀粉酶活性呈正相關，其對淀粉酶活性的影響較可溶性淀粉+玉米淀粉強，并且兩因素的交互作用較強。蛋白胨+酵母粉對淀粉酶活性的影響較CaCl2更顯著。當?shù)鞍纂?酵母粉質量濃度在10～15 g/L 時，隨著質量濃度的增加，淀粉酶活性緩慢增加；當質量濃度>15 g/L時，淀粉酶活性隨著質量濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢。培養(yǎng)溫度對淀粉酶活性的影響較蛋白胨+酵母粉顯著，交互作用不顯著。轉速對淀粉酶活性的影響較蛋白胨+酵母粉顯著，交互作用較為顯著。培養(yǎng)溫度對淀粉酶活性的影響較CaCl2更顯著。CaCl2質量濃度和轉速單因素對淀粉酶活性均具有顯著影響，但兩者交互作用不顯著。培養(yǎng)溫度與轉速間的交互作用不顯著。

圖9 各因素交互作用對淀粉酶活性的影響Fig.9 Effects of interaction between different factors on amylase activity

續(xù)表2 回歸模型方差分析結果Tab.2（Continued） Analysis of variance of regression model

綜上所述，蛋白胨+酵母粉質量濃度與轉速的交互作用顯著，可溶性淀粉+玉米淀粉質量濃度與培養(yǎng)溫度、可溶性淀粉+玉米淀粉質量濃度與轉速、蛋白胨+酵母粉質量濃度與CaCl2質量濃度、CaCl2質量濃度與培養(yǎng)溫度的交互作用極顯著，影響淀粉酶活性的主次因素為轉速>培養(yǎng)溫度>可溶性淀粉+玉米淀粉質量濃度>蛋白胨+酵母粉質量濃度>CaCl2質量濃度。

2.2.3 響應面試驗方案優(yōu)化及結果驗證 響應面試驗結果顯示，培養(yǎng)基的最佳配方為可溶性淀粉+玉米淀粉質量濃度15.69 g/L、蛋白胨+酵母粉質量濃 度16.87 g/L、CaCl2質 量 濃 度5.91 g/L，溫 度 為36.83 ℃、轉速為189.71 r/min，此時理論酶活性為223.18 U/mL。對最佳培養(yǎng)條件進行驗證，得到酶活性為223.45 U/mL，與理論值基本吻合。與初始酶活性（116.05 U/mL）相比，酶活性提高92.55%。

2.3 發(fā)酵前后煙葉中淀粉含量及常規(guī)化學成分含量變化

以蒸餾水處理為對照，分析SY-1 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化前后所產酶液對煙葉中淀粉及常規(guī)化學成分含量的影響。與對照相比，經酶液處理后煙葉淀粉含量均顯著降低（表3）。產酶條件優(yōu)化前，SY-1酶液對煙葉淀粉的降解率為16.88%；產酶條件優(yōu)化后，SY-1 酶液對煙葉淀粉的降解率達40.68%。與優(yōu)化前酶液處理相比，優(yōu)化后酶液處理水溶性總糖和還原糖含量分別提高5.91%和7.84%；總氮含量和煙堿含量分別下降4.23%和2.84%，糖堿比、氮堿比得到提升，兩糖差有所下降。降低兩糖差有利于提高煙葉吃味品質，且煙葉煙氣醇和度及香氣與還原糖呈極顯著正相關，還原糖是香氣前提，對煙葉感官質量有顯著影響[17?18]。

表3 發(fā)酵前后煙葉中淀粉含量及常規(guī)化學成分含量變化Tab.3 Changes of starch and conventional chemical composition content of tobacco leaves before and after fermentation

3 結論與討論

蘇云金芽孢桿菌SY-1 以混合淀粉為碳源時酶活性最高，是因為淀粉作為多糖，除了能被微生物分解成葡萄糖外還能提供麥芽糖，能保證菌株的多元化營養(yǎng)，且混合淀粉中含有更豐富的營養(yǎng)物質以及多種礦質元素，從而促進了菌體的繁殖和芽孢的形成，增強了微生物代謝活力，從而提高了淀粉酶活性[19]。有機氮源的酶活性明顯高于無機氮源。這是因為有機氮源含有豐富的氨基酸、維生素及生長因子等營養(yǎng)物質，其中氨基酸可直接參與微生物體內的轉氨或脫氨作用[20]，維生素可作為一些酶的輔因子參與胞內生命活動[21]。相較于單一有機氮源，蛋白胨+酵母粉作為混合氮源時酶活性最高，由于酵母粉蛋白質分子比蛋白胨分子小，有利于菌體吸收，促進菌體生長；蛋白胨則有利于菌體穩(wěn)定期的延長，促進菌體代謝及產酶[22]。陳宇熹等[23]認為，Ca2+有利于芽孢的形成，并且對發(fā)酵液pH 值具有調節(jié)作用，與本研究結果一致。不同菌株的最適培養(yǎng)溫度不同，經產酶優(yōu)化后的蘇云金芽孢桿菌最適培養(yǎng)溫度與枯草芽孢桿菌[24]最適溫度37 ℃接近。轉速較楊磊等[25]研究中的轉速150 r/min 高，適當增大轉速能增大瓶內溶氧量，發(fā)酵液中傳質和傳熱速度加快，有利于菌體生長代謝與產酶；轉速太高，溶氧量高于菌體所需水平，會導致培養(yǎng)基中有氣泡產生，影響菌體呼吸，從而影響菌體生長及產酶[26]。

通過產酶條件的單因素試驗及Box-Behnken響應面設計試驗，分析得到最佳產酶條件：可溶性淀粉+玉米淀粉質量濃度15.69 g/L，蛋白胨+酵母粉質量濃度16.87 g/L，CaCl2質量濃度5.91 g/L，溫度為36.83 ℃、轉速為189.71 r/min。SY-1 菌株在經過產酶條件優(yōu)化后，淀粉酶活性達223.45 U/mL，與發(fā)酵條件優(yōu)化前相比，酶活性提高92.55%，明顯高于聶晶晶等[27]報道的解淀粉芽孢桿菌淀粉酶活性（70.2 U/mL）。

蘇云金芽孢桿菌SY-1 經產酶條件優(yōu)化后的酶液具有更高效的煙葉淀粉降解能力，淀粉降解率提高23.80 個百分點。淀粉含量過高不僅會影響燃吸的速度和完全性，還會產生焦糊氣味以及多種有害成分，降低了卷煙的安全性[28]。目前，調制后煙葉淀粉含量普遍偏高，已成為制約我國煙葉質量提高的重要因素[4]。煙葉中的淀粉可通過降解轉化為還原糖等小分子物質，進而促進香味物質的生成，改善抽吸品質[29]。提高蘇云金芽孢桿菌SY-1 的淀粉酶活性能夠顯著提高煙葉淀粉的降解效率并提高煙葉品質。