楊 鑫 黃 坤 胡靖蕊 曾麗雯 楊世勇 武佳韻

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 雅安 625000; 2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院, 溫江 611130)

周公河發(fā)源于滎經(jīng)、漢源和洪雅三縣交界處的老鷹咀, 在瓦屋山鎮(zhèn)附近匯合后始稱周公河, 由南向北至雅安城下游2 km處匯入青衣江, 全長95.6 km,流域面積1120 km。周公河河道曲折、灘高水急、灘沱交替, 總落差約1700 m, 水力資源豐富。為開發(fā)周公河的水能資源, 當?shù)卣谥芄由闲藿送呶萆?、葫蘆壩、將軍坡、沙坪、河坪和大石板等多個水電站。然而, 水利水電工程的建設(shè)所引起的水環(huán)境的變化對于魚類的生存存在嚴重影響, 水電站泄洪時引起的下游總?cè)芙鈿怏w(TDG)過飽和現(xiàn)象會導(dǎo)致魚類出現(xiàn)明顯的氣泡損傷, 死亡率也隨著TDG的過飽和度上升而增長[1,2]。此外, 水利樞紐的建設(shè)還有可能會阻斷不同區(qū)段魚類的基因交流,使魚類的生境和遺傳結(jié)構(gòu)片段化而導(dǎo)致魚類區(qū)系組成及群落結(jié)構(gòu)改變[3], 對洄游性魚類的影響尤為顯著。水電站蓄水引起水文和水環(huán)境的改變會直接影響洄游性魚類的產(chǎn)卵量, 徐薇等[4]調(diào)查了銀盤電站蓄水前后烏江下游洄游性魚類的自然繁殖的變化, 結(jié)果顯示產(chǎn)卵規(guī)模顯著下降, 并且在所采集到的魚卵種類組成中發(fā)現(xiàn)典型的流水生境繁殖類群減少, 緩靜水生境繁殖類群增加。Quan等[5]研究了黃河源區(qū)水電站的建立對黃河本土魚類花斑裸鯉(Gymnocypris eckloni Herzensten)產(chǎn)卵率及卵存活率的影響, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)水力發(fā)電導(dǎo)致的水溫降低將推遲花斑裸鯉的產(chǎn)卵期, 卵孵化的過程中將面臨更高的風險。

齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti), 俗稱雅魚,是鯉科(Cyprinidae)裂腹魚屬(Schizothorax)的冷水性魚類。周公河是其發(fā)源地之一, 齊口裂腹魚曾是當?shù)刂饕臐O獲物, 占捕撈產(chǎn)量的70%左右; 然而近年來, 由于環(huán)境污染和過度捕撈等原因, 周公河中齊口裂腹魚種群數(shù)量明顯下降。在2002年周公河珍稀魚類省級自然保護區(qū)成立后, 政府采取了一系列保護及增殖放流措施, 致力于保護周公河野生魚類的自然種群資源, 在2010年前后針對種群數(shù)量較小的鱸鯉和重口裂腹魚進行了人工增殖放流工作, 并未放流齊口裂腹魚, 對齊口裂腹魚自然種群的遺傳起到了保護作用。

動物線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)呈母系遺傳, 具有較高的突變率, 而線粒體控制區(qū)(D-loop)屬于線粒體DNA中的非編碼區(qū), 是線粒體DNA中進化速率最快的序列, 被廣泛應(yīng)用于魚類群體遺傳學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)的研究[6—8]。本研究在周公河上中下游分別設(shè)定采樣點, 采用D-loop序列為分子標記研究了不同河段齊口裂腹魚的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu), 為周公河齊口裂腹魚資源的有效保護和水電站建設(shè)的環(huán)境影響評估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣地點

沿周公河上下游連續(xù)設(shè)立6個采樣點(圖1), 在漁政部門的協(xié)助下進行隨機采集。在2016年7月至2018年9月間共采集野外齊口裂腹魚樣本63尾, 其中A(瓦屋山大壩王坪)采集12尾, B(瓦屋山大壩下游)采集6尾, C(羅壩)采集12尾, D(將軍坡電站下游)采集15尾, E(羅村河大橋)采集14尾, F(張家灣)采集4尾。收集的樣本在進行基本生物學(xué)測量之后取其鰭條進行DNA提取, 其余組織保存于100%酒精中。

圖1 齊口裂腹魚采樣位點圖Fig. 1 Sampling locations of S. prenantiA. 瓦屋山大壩王坪; B. 瓦屋山大壩下游; C. 羅壩; D. 將軍坡電站下游; E. 羅村河大橋; F. 張家灣A. Wangping of Wawushan Dam; B. Downstream of Wawushan Dam; C. Luoba; D. Downstream of Jiangjunpo Hydropower Station; E. Luocun River Bridge; F. Zhangjiawan

1.2 實驗內(nèi)容及方法

基因組DNA提取及目的基因擴增采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(TIANGEN, 北京)提取齊口裂腹魚基因組DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 以提取的DNA為模板,用鯉科魚類線粒體控制區(qū)通用引物[9]DL1(5′-ACCC CTGGCTCCCAAAGC-3′) 和DH2 (5′-ATCTTA GCATCTTCAGTG-3′) 進行PCR擴增。擴增采用25 μL體系, 含有TaqE 12.5 μL, 模板DNA1 μL, 上下游引物各0.5 μL, 其余用超純水補足。PCR擴增條件為95℃預(yù)變性4min, 92℃變性30s, 55℃退火1min,72℃延伸1min, 重復(fù)35個循環(huán)后4℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物, 使用DNA純化回收試劑盒(TIANGEN, 北京)進行膠回收后送英駿公司進行測序。

數(shù)據(jù)分析測序結(jié)果用Chromas和Contig軟件進行排序和拼接, 輔以人工校對, 去除雜峰, 保留有效片段后使用Mega5.0軟件進行序列變異情況、堿基組成及單倍型組成分析; 用PAUP軟件依據(jù)最大似然法構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹, 自展檢驗(Bootstrap test)評估所建系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性, 重復(fù)1000次評估各分支的置信值; 用DnaSP 4.0軟件分析單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性, 并計算種群間的遺傳分化系數(shù)Fst, 使用公式Nm=(1–Fst)/2Fst計算群體間的基因流(Nm)。Arlequin軟件進行AMOVA分析[10]。

2 結(jié)果

2.1 堿基組成及變異特征

本研究獲得齊口裂腹魚線粒體DNA D-loop區(qū)的長度為922 bp, 其基本結(jié)構(gòu)可分為中間保守區(qū)和2個側(cè)翼區(qū)。所有個體T、C、A和G 四種核苷酸的平均比例分別為33.1%、19.8%、32.8%和14.3%(表1),其中A+T含量(65.9%)明顯高于C+G(34.1% ), 具有反G偏倚的特點, 符合魚類線粒體控制區(qū)的堿基結(jié)構(gòu)特征[11]。共獲得32個單倍型, 從中檢測到10個核苷酸變異位點, 占位點總數(shù)的0.011%, 均為簡約信息位點(表2)。

表2 齊口裂腹魚種群單倍型多態(tài)位點和個體數(shù)Tab. 2 Mutation sites and number in different haplotypes of S. prenanti populations

2.2 種群遺傳多樣性

周公河中齊口裂腹魚種群的總核苷酸多態(tài)性為0.013, 其在不同種群中的變動范圍為0.010—0.018; 總單倍型多態(tài)性為0.966, 不同種群中的變動范圍為0.867—1.000(表1)。種群Pop F呈現(xiàn)出最大的遺傳多樣性(π=0.018,h=1.000); PopC的核苷酸多樣性最低(π=0.010,h=0.970), 而PopB的單倍型多樣性最低(π=0.015,h=0.867)。

表1 齊口裂腹魚種群線粒體控制區(qū)堿基組成及多態(tài)性指數(shù)Tab. 1 Nucleotide composition and genetic diversity index of S. prenanti populations

2.3 種群間遺傳分化

種群遺傳學(xué)認為當Fst值在0—0.05時, 遺傳分化較弱; 當Fst值在0.05—0.15時, 遺傳分化中等; 當Fst值在0.15—0.25, 遺傳分化較大; 當Fst值大于0.25時, 遺傳分化極大[12]。在本研究的6個齊口裂腹魚種群中, Pop C和Pop F間(Fst=0.195,P<0.01), Pop A和PopE間(Fst=0.158,P<0.01)的遺傳分化較大且分化顯著; PopE和PopF(Fst=0.045), PopB和PopD(Fst=0.049)之間的遺傳分化較弱; 其他種群間均呈現(xiàn)中等水平的遺傳分化(0.051時, 基因流能夠抵制遺傳漂變的作用, 可防止種群間遺傳分化的產(chǎn)生[12]。本研究中6個種群間的基因流均大于1, 其中最大的為6.685(PopB和PopE之間), 最小的為1.033(PopC和PopF之間); 所有種群間基因流的平均值為3.110(表3)。AMOVA分析顯示, 9.17%的遺傳變異來自群體間, 而90.83%來自于群體內(nèi)部。

表3 齊口裂腹魚種群間遺傳分化系數(shù)(Fst)及基因流(Nm)Tab. 3 Genetic differentiation index (Fst) and gene flow (Nm)among S. prenanti populations

2.4 單倍型分布

在定義的32個單倍型中有19個私有單倍型,13個共享單倍型。共享單倍型集中在Pop D和PopE(各4個); PopA和PopC、Pop E各有兩個共享單倍型; PopC和PopB、PopD各有兩個共享單倍型;PopA和PopB、PopD、PopF各有1個共享單倍型;PopF和PopD、PopE各有1個共享單倍型。單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖顯示, 在將軍坡電站下游的種群獨成一支, 且以單倍型hap21為中心(圖2)。

圖2 基于控制區(qū)序列構(gòu)建齊口裂腹魚種群的單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖Fig. 2 Median-joining network of the halpotypes of S. prenanti populations based on control region

續(xù)表 2

2.5 單倍型系統(tǒng)發(fā)育

以懷頭鯰(Silurus soldatovi)和歐鯰(Silurus glanis)為外群, 以最大似然法(ML)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示: 所有的單倍型分為4支, 主要來自PopD種群的11個單倍型形成Clade A; 主要來自PopA種群的6個單倍型形成Clade B; 主要來自PopC種群的6個單倍型構(gòu)成Clade C; 而主要來自PopB種群的9個單倍型構(gòu)成Clade D(圖3)。單倍型在種群間相互交叉分布的現(xiàn)象普遍。

圖3 齊口裂腹魚種群單倍型ML分子系統(tǒng)樹Fig. 3 ML phylogegenetic tree of the haplotypes of S. prenanti populations

3 討論

物種的遺傳多樣性高低與其適應(yīng)能力、生存能力和進化潛力密切相關(guān)[13]。張爭世等[14]使用線粒體片段檢測了長江上游4個齊口裂腹魚野生群體(重慶巫溪大寧河、重慶城口任河、四川雅安大渡河和四川阿壩腳木足河)的遺傳特性, 結(jié)果顯示這4個齊口裂腹魚種群的π的變動范圍為0.007—0.012,h的變動范圍為0.704—0.884, 且四川雅安群體與四川阿壩群體間遺傳分化最小, 基因交流頻繁。與張爭世等[14]的研究相比, 本研究中6個齊口裂腹魚群體的π值和h值略高, 但差異不大, 可能是周公河流域內(nèi)部以及周公河與其他地區(qū)之間都存在一定的基因交流。本研究中PopF的π和h值最高(π=0.018,h=1.000), 遺傳變異最豐富, 遺傳多樣性最高, 而PopB(h=0.867)和PopE(h=0.879)的h值較小,PopA(π=0.011)和PopC(π=0.010)的π值較小。PopF相對較高的遺傳多樣性可能與其采樣地較適宜的水文條件和生存環(huán)境有關(guān), 或者與其樣本量較少有關(guān)。

Liang等[15]于2011年使用線粒體控制區(qū)序列檢測了5個齊口裂腹魚種群(高原湖泊伍須海、九龍河、木里河、大渡河和青衣江)的遺傳特性, 其中青衣江齊口裂腹魚種群的π為0.018,h為0.990。周公河與青衣江水路相通, 由南向北匯入青衣江。本研究中周公河齊口裂腹魚群體的遺傳多樣性(π=0.0132,h=0.966)與Liang等[15]的研究幾乎一致。在本研究的6個采樣點中, PopD上游為將軍坡水電站, 下游為沙坪水電站, 是唯一一個上、下游均有隔離的采樣點。單倍型系統(tǒng)發(fā)育及遺傳分化分析顯示, 該采樣點的齊口裂腹魚種群與其他種群間不僅有一定的共享單倍型, 且遺傳分化較小。魚類資源調(diào)查顯示, 該河段沿岸居民較少, 人為影響較小, 且水質(zhì)清澈, 非常適宜齊口裂腹魚的生存,此河段的齊口裂腹魚種群數(shù)量亦較大。PopD上下游的水電站建設(shè)似乎對裂腹魚資源的遺傳結(jié)果影響不大。

本研究中相鄰采樣點間的遺傳分化除瓦屋山大壩王坪(A)和瓦屋山大壩下游(B)間遺傳距離較大外, 其他均較小。瓦屋山水電站始建于2003年, 是周公河上蓄水量(約5.84×108m3)及建筑施工量最大的水電站, 且已于2008年投入使用。本研究中亦檢測出AB采樣點間的基因流Nm為3.238, 該基因交流可能主要形成于瓦屋山水電站修建之前, 而該水電站的修建可能在一定程度上影響了水電站上下游齊口裂腹魚資源的基因交流。

周公河中齊口裂腹魚種群的遺傳多樣性較高,不同河段的遺傳多樣性指數(shù)差異不大。各采樣點的齊口裂腹魚種群間遺傳分化水平多中等或偏低,存在較密切的遺傳關(guān)系。水電站的建設(shè)對周公河中的齊口裂腹魚群體產(chǎn)生了一定的影響, 但尚未形成較大隔離效應(yīng)。