李建兵,包衛(wèi)東

(1.甘肅省小隴山林業(yè)調查規(guī)劃院,甘肅 天水 741020；2.甘肅省小隴山林業(yè)實驗局 ,甘肅 天水 741020)

七葉樹(學名：AeculuschinensisEunge)，為甘肅省珍稀頻危省級保護樹種之一，在中國秦嶺西段的小隴山林業(yè)實驗局林區(qū)多有分布。七葉樹是著名觀賞樹種，同時，還具有藥用及經(jīng)濟價值，可供小工藝品及家具等用材。通過運用組織培養(yǎng)快繁技術，使其不僅具有遺傳性狀相對穩(wěn)定、增殖快、繁殖系數(shù)高、產量高、品質好、生產周期短等特點，而且受氣候、季節(jié)影響小，便于操作，可節(jié)省大量人力物力。筆者參與了七葉樹組織培養(yǎng)工作，并對該技術進行了初步研究，歸納總結了一些成熟的做法和結論，以便在生產實踐中予以推廣應用。

1 實驗原理

通過對莖尖材料的無菌培養(yǎng)，研究器官分化和在離土培養(yǎng)條件下培養(yǎng)材料(外植體)的生長發(fā)育規(guī)律，以及影響這些過程的各種因素。

2 實驗設施

2.1 無菌操作室

無菌操作裝置是接種箱(超凈工作臺)，內附空氣過濾系統(tǒng)、光照系統(tǒng)、紫外燈。

2.2 培養(yǎng)室

七葉樹組織和細胞培養(yǎng)室里，需要具有照明和控溫設備，為七葉樹外植體生長及發(fā)育提供所需要的環(huán)境，比如溫度、濕度、光照、通風等。一般要求溫度在25±1℃之間。光源一般采用白色熒光燈或自然光線，每天光照約16h，光強為200001x左右。還需要配備有常用的培養(yǎng)架，用于固體培養(yǎng)。

2.3 組織培養(yǎng)所需的各種用具

(1)三角瓶或燒杯(100ml，250ml，500ml，1L)；(2)玻璃攪拌棒；(3)冰箱；(4)空調；(5)牛角勺；(6)剪刀；(7)器械架；(8)純水水桶；(9)量簡(25lm，50ml，100ml，1L)；(10)容量瓶(100ml，500ml，1L)；(11)刻度移液管(1kl，2ml，5ml，10ml)；(12)藥物天平；(13)磨砂口玻璃瓶； 用來對植物材料進行表面滅菌。(14)酒精燈；(15)無菌濾紙 ；(16)高壓滅菌鍋或家用樂力鍋；(17)可調式電爐；(18)酸度計；(19)鑷子；(20)解剖刀；(21)培養(yǎng)皿；(22)錐形瓶；(23)室內小推車。

2.4 器皿和器械消毒

為了能夠徹底滅菌，將七葉樹玻璃培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)基分開進行，先對培養(yǎng)容器用高壓蒸汽滅菌法消毒，再對培養(yǎng)基用常規(guī)法滅菌，也可將它們置于烘箱中在160℃～80℃下干熱處理3h。無菌操作中使用的各種器械都必須進行消毒，方法是：將它們依次放在95%酒精中浸一下，然后放置在火焰上灼燒，待冷卻后使用，操作期間還要消毒幾次。

3 實驗過程

3.1 實驗材料的準備

3.1.1 培養(yǎng)基的配制

采用MS(Murashige和Skoog, 1962)培養(yǎng)基。

3.1.2 培養(yǎng)基成分

實驗中，七葉樹組織培養(yǎng)采用的是MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的pH值要求在5.8-6.0范圍內。

3.1.3 培養(yǎng)基母液裝瓶及滅菌

培養(yǎng)基母液配制好后，分別按規(guī)定吸取量吸取，加入瓊脂、蔗糖混成1∶1溶液煮成培養(yǎng)基，然后進行分裝入瓶.入瓶后要立刻用封口膜將容器口處理好，以確保不變干，不被污染。已經(jīng)封裝好的培養(yǎng)基放入高壓鍋中進行高溫滅菌，溫度控制在130～135℃之間，保持10min即可。

3.1.4 培養(yǎng)基的保存

經(jīng)過3天預培養(yǎng)的七葉樹培養(yǎng)基，滅菌完畢后，放置于防塵、避光、恒溫處。

3.1.5 外植體處理

培養(yǎng)材料的采集,選用當年生嫩枝作為外植體(植物器官)。將采收下來的外植體先置于燒杯中，用流動的自來水沖洗20～60min，再用無菌水漂洗1～3次。把沖洗好的外植體放在磨砂口的玻璃瓶中,傾入70%(濃度)的乙醇沒過外植體，并輕晃以除去附著物，經(jīng)過10～20s將乙醇倒去,用無菌水沖洗。接下來再用配制好一定濃度的氯化汞溶液泡外植體5～10min。將消毒水倒出再注入無菌水，搖動數(shù)次后倒出，重復3次。滅菌后，將外植體從瓶中取出放于滅菌過的過濾紙上，把材料上的水吸掉等待接種。

3.2 操作步驟

3.2.1 接種操作

1)接種前器械必須進行消毒，方法是先用水洗凈，再用牛皮紙包裹好放入高壓鍋內進行40～60分鐘的滅菌。在進行接種時，先用70%酒精進行表面消毒，再用火灼燒、冷卻。超凈工作臺應先用70%的酒精擦拭一遍，再用紫外燈照射20min。接種工作人員必須穿消過毒的工作服，戴消過毒的口罩，進入工作臺前手要用70%酒精進行消毒。

2)接種時左手拿起三角瓶，右手輕輕取下封口膜，動作要慢，以免氣流沖入瓶中造成污染。將三角瓶的口靠近酒精燈火焰上燎數(shù)下，將灰塵物等固定在原處，然后用鑷子將外植體送入瓶中插在培養(yǎng)基上，將鑷子放入消毒酒精中，再把封口膜在火焰上旋轉灼燒一下，封上口，做好標記，材料接種完畢。

3)接種后3-7天內要每天檢查，主要是看有無污染情況發(fā)生，細胞觀察每隔3-5天看一次并記錄結果。

3.2.2 初代培養(yǎng)

經(jīng)過3-10天的培養(yǎng)，管苗會生出少量不定芽，發(fā)現(xiàn)后要做詳細記錄。同時適量添加一些營養(yǎng)元素，以提高出芽率。

3.2.3 繼代培養(yǎng)

經(jīng)過2-6周左右，可分化出大量的不定芽。當觀察到七葉樹外植體上的嫩莖長到一定高度時，就可以切割并轉接到生根培養(yǎng)基上，進行生根誘導了。

3.2.4 試管苗出瓶

在生根培養(yǎng)基的誘導下嫩莖長出可進行移栽的根系，即可進行出瓶了。在七葉樹試管苗出瓶之前，最好進行一些適應性處理，具體包括透氣鍛煉和脫去基質兩個方面：

1)透氣鍛煉。把試管苗移放到要進行移栽的地方，以便適應外界的變化，隨后把瓶口上的封口膜逐次打開，進行通風處理，使其適應生長地空氣環(huán)境，使植株的成活率生長狀況保持穩(wěn)定。

2)脫去基質。管苗在移前還要把根系上粘著的培養(yǎng)基和水沖凈，以免因感染細菌而導致根系發(fā)育受到影響，最后就可以將管苗移栽到經(jīng)過滅菌處理的珍珠巖上或蛭石等基質中。

3.2.5 試管苗移栽

實驗證明，用七葉樹組培法繁育的幼苗不同于大田苗，必須經(jīng)歷一個煉苗的過渡期，才能適應外界環(huán)境，也才能更好地生長。

1)煉苗處理措施:通過控水、減肥、爭光、降溫等措施。

2)試管苗的煉苗技術：為了提高七葉樹組培苗的成活率和保存率，必須采取煉苗措施。具體包括以下三個方面：對于準備移栽的試管苗在培養(yǎng)基中加入矮狀素；并在移植前把試管苗放在室內高臺處散射光強的地方；使幼苗經(jīng)過5天的鍛煉后再移栽。

4 結論與注意事項

對七葉樹苗木進行組織和細胞培養(yǎng)是可行的，小隴山林區(qū)可以進行該技術的推廣應用。在實驗與應用過程中應注意以下事項：

1)對一個樹種進行組培快速繁殖，是一個非常精密的系統(tǒng)工程，必須環(huán)環(huán)相扣。

2)在研究過程中必須嚴格執(zhí)行相關技術規(guī)定和技術標準要求。

3)應按部就班進行。