姚瑩瑩，王 靖，徐倩倩，周秀玲，張 揚

(聊城大學生命科學學院，山東 聊城 252059)

甾體藥物具有顯著的抗過敏、抗感染、抗休克等生理和藥理功能，特別是激素類甾體藥物在消炎及內(nèi)分泌調(diào)控等方面屬剛需用藥，其臨床用藥已超300余種，是僅次于抗生素的第二大類藥物，市場前景十分廣闊[1-3]。甾體藥物的分子結(jié)構(gòu)精巧且復雜，很難通過全合成法來生產(chǎn)。雄烯二酮(雄甾-4-烯-3,17-二酮，AD)作為甾體藥物核心中間體可合成絕大部分激素類甾體藥物。植物甾醇是廣泛存在于植物中的甾體化合物，工業(yè)上主要是從植物油油腳中提取獲得。植物甾醇具有廉價易得、環(huán)境友好以及無需深度純化即可用于AD生產(chǎn)的特性[4]。以植物甾醇為底物，微生物合成AD技術(shù)體系的建立，為甾體藥物工業(yè)化生產(chǎn)步入綠色化工時代奠定了堅實基礎，為全球甾體醫(yī)藥行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展開辟了新的途徑[5]。

雖然有多個種屬的微生物被證實具有AD生產(chǎn)能力，例如分枝桿菌屬、節(jié)桿菌屬、短桿菌屬、假單胞菌屬和紅球菌屬等，但僅有分枝桿菌屬菌株被成功用于工業(yè)化生產(chǎn)[6-7]。分枝桿菌能耐受高濃度有機環(huán)境、轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)AD，是理想的工業(yè)生產(chǎn)菌[8]。但植物甾醇較低的水溶性(<0.1 mmol·L-1)及菌株攝入能力導致菌株轉(zhuǎn)化周期長、轉(zhuǎn)化效率低[9]。因此，提高菌株對植物甾醇的轉(zhuǎn)運能力有利于AD的生產(chǎn)。在結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌中，脂肪酸和甾醇的攝入是由龐雜的Mce轉(zhuǎn)運系統(tǒng)完成的，基因轉(zhuǎn)錄水平分析和敲除研究表明，在4種組成Mce轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的體系中，Mce4體系是膽固醇攝取所必需的[10-12]。Mce4體系由6種細胞壁相關Mce蛋白、2種Mce相關膜蛋白、2種滲透酶、2種孤立的Mce相關膜蛋白以及1種ABC轉(zhuǎn)運體ATP酶(MceG)組成[13]。其中，MceG作為Mce4體系的能量提供者是必需的。在絕大部分含有Mce轉(zhuǎn)運體基因簇的放線菌中都有MceG同源物[14]。在缺失MceG的情況下，恥垢分枝桿菌不能利用膽固醇或植物甾醇作為碳源[15]。同樣，結(jié)核分枝桿菌中mceG的缺失顯示出膽固醇攝入缺陷，并導致其對小白鼠侵染能力的降低[16]。He等[17]將Mycobacteriumtuberculosis的MceG和Mce4轉(zhuǎn)運體系2個膜蛋白基因yrbE4A和yrbE4B經(jīng)密碼子優(yōu)化后在菌株Mycobacteriumsp.MS136中進行表達，重組菌9α-羥基-4-雄甾烯-3,17-二酮的產(chǎn)量提高了20%。因此，MceG作為Mce4轉(zhuǎn)運體系唯一的能量供應ATP酶，對Mce4轉(zhuǎn)運體系攝取植物甾醇具有重要意義。基于此，作者以分枝桿菌Mycobacteriumsp.LZ2(M.sp.LZ2)的Mce轉(zhuǎn)運體ATP酶(LzMceG)為研究對象，在同源序列比對的基礎上獲得lzmceG基因全長序列信息，并進行生物信息學分析，構(gòu)建LzMceG過表達菌株，并對重組菌株的生長和植物甾醇轉(zhuǎn)化能力進行檢測，以研究LzMceG過表達對分枝桿菌轉(zhuǎn)化植物甾醇的影響。

1 實驗

1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

原始菌株：分枝桿菌Mycobacteriumsp.LZ2(M.sp.LZ2)，保藏于聊城大學生命科學學院?？寺∷拗鳎篍scherichiacoliDH5α，用于重組質(zhì)粒的構(gòu)建和保存。表達型質(zhì)粒pMV261：分枝桿菌和E.coli的穿梭質(zhì)粒，卡那霉素抗性，用于MceG的過表達。本研究所使用的引物信息見表1。

表1 引物信息Tab.1 Information of primers

1.2 試劑、培養(yǎng)基與儀器

植物甾醇，陜西林洲生物科技有限公司；環(huán)糊精，山東濱州智源生物科技有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、過氧化氫酶活性檢測試劑盒、溶菌酶，北京索萊寶科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、卡那霉素、即用型無縫克隆試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；Taq DNA聚合酶、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；細菌活性檢測試劑盒，碧云天。

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基：氯化鈉10 g·L-1，胰蛋白胨10 g·L-1，酵母粉 5 g·L-1;pH值 7.0，121 ℃、高壓滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入20 g·L-1瓊脂粉。

M.sp.LZ2斜面培養(yǎng)基：K2HPO40.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，檸檬酸 2 g·L-1，丙三醇 2 g·L-1，葡萄糖0.5 g·L-1，碳酸鈣 10 g·L-1;pH值 7.0，115 ℃、高壓滅菌20 min。

M.sp.LZ2種子培養(yǎng)基：K2HPO40.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，檸檬酸 2 g·L-1，丙三醇 2 g·L-1，葡萄糖0.5 g·L-1;pH值 7.0，115 ℃、高壓滅菌20 min。

M.sp.LZ2發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g·L-1，檸檬酸 2 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，K2HPO40.5 g·L-1，(NH4)2HPO43.5 g·L-1，環(huán)糊精 38 g·L-1，植物甾醇 5 g·L-1;pH值 7.2；葡萄糖115 ℃、高壓滅菌20 min，其它成分121 ℃、高壓滅菌20 min。

UV752N型紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；T100型梯度基因擴增儀，美國Bio-Rad公司；ZF-288型全自動凝膠成像分析系統(tǒng)，上海嘉鵬科技有限公司；Infinite M200型多功能酶標儀，奧地利TECAN公司；UltiMate 3000型高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1lzmceG基因全長序列信息獲取

目前，M.tuberculosisH37Rv的MceG研究較為深入，利用BLAST的blastn程序以其MceG的mkl基因(Gene ID:888081)序列為查詢序列，與M.neoaurumVKM Ac-1815D全基因組進行比對分析，獲得相似度最高的基因序列。根據(jù)其基因序列信息設計引物(MG-F/MG-R)，以M.sp.LZ2基因組為模板，PCR獲得目的基因片段，切膠回收純化后，送上海生工生物測序以獲得lzmceG基因全長序列信息。

1.3.2 LzMceG生物信息學分析

LzMceG的理化性質(zhì)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細胞定位及結(jié)構(gòu)域，分別使用ProtParam、SignalP Server、TMHMM Server、PSORTb及Conserved Domains(CDD)數(shù)據(jù)庫進行分析和預測。LzMceG的三級結(jié)構(gòu)同源性建模使用SWISS-MODEL完成。利用ClustalX進行同源序列比對，比對結(jié)果導入到MEGA 7中,使用鄰接法(Neighbor-Joining)及自長支持率(bootstrap)1 000次重復構(gòu)建LzMceG系統(tǒng)進化樹。

1.3.3 LzMceG表達質(zhì)粒構(gòu)建

使用引物MG-F/MG-R,以M.sp.LZ2全基因組為模板，PCR擴增獲得含有l(wèi)zmceG基因的核苷酸片段。將所獲得的PCR產(chǎn)物進行切膠回收,-80 ℃保存?zhèn)溆?。從質(zhì)粒pMV261的保存菌株E.coliDH5α/pMV261中提取質(zhì)粒pMV261，利用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后與含有l(wèi)zmceG基因的核苷酸片段連接。連接體系及操作按照即用型無縫克隆試劑盒說明書進行。取10 μL連接產(chǎn)物，42 ℃熱激化轉(zhuǎn)至E.coliDH5α中，經(jīng)孵育、抗性篩選獲得陽性克隆。挑選3～5個陽性克隆抗性培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進行PCR及測序驗證。將驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pMV261-lzmG，質(zhì)粒保存菌株命名為E.coliDH5α/pMV261-lzmG。

1.3.4 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化及陽性克隆篩選

擴培E.coliDH5α/pMV261-lzmG，利用質(zhì)粒提取試劑盒獲得濃度為100～150 ng·μL-1的重組質(zhì)粒。取10 μL重組質(zhì)粒加入到100 μLM.sp.LZ2感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴預冷25 min后，加入到同樣預冷的1 mm電轉(zhuǎn)杯中，在1.5～2.0 kV電壓下電擊4～5 ms；電擊結(jié)束后迅速冰浴靜置5 min，同樣條件下再次電擊，然后冰浴靜置10 min。向電轉(zhuǎn)杯中加入700 μL LB培養(yǎng)基，充分混勻后轉(zhuǎn)入無菌離心管中，在30 ℃、200 r·min-1條件下活化4～5 h?；罨蟮木涸谑覝叵? 000 r·min-1離心4 min，棄500 μL上清液；將剩余的菌液混勻后涂布至含卡那霉素(50 μg·mL-1)LB平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)4～6 d。挑取陽性克隆于裝有抗性LB培養(yǎng)基的試管中，在30 ℃、200 r·min-1條件下，搖床振蕩培養(yǎng)3～4 d，提取質(zhì)粒，進行雙酶切及測序驗證。將驗證正確的重組菌株命名為M.sp.LZ2/pMV261-lzmG。

1.3.5 RNA提取和RT-qPCR分析

分別將M.sp.LZ2和M.sp.LZ2/pMV261-lzmG在發(fā)酵48 h和72 h時取樣收集菌體。按照RNA提取試劑盒說明書提取樣本總RNA。按照RT-qPCR試劑盒說明書推薦的反應體系及條件，進行逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR。以16S rRNA作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt方法分析lzmceG基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.3.6 產(chǎn)物分析

在搖瓶中進行M.sp.LZ2和M.sp.LZ2/pMV261-lzmG生產(chǎn)能力評估，在30 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)168 h，每間隔24 h取樣一次。向發(fā)酵樣品中加入等體積乙酸乙酯，超聲30 min，12 000 r·min-1離心10 min；吸取100 μL上清液，室溫揮干后，用80%甲醇重懸樣品，超聲30 min，12 000 r·min-1離心20 min，經(jīng)0.22 μm濾頭處理后進行HPLC分析。色譜條件：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm)，柱溫30 ℃，流動相甲醇-水(8∶2，體積比)，流速1 mL·min-1，檢測波長254 nm，進樣量10 μL。M.sp.LZ2能將小部分產(chǎn)物AD進一步轉(zhuǎn)化為雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)。因此，M.sp.LZ2轉(zhuǎn)化植物甾醇的產(chǎn)物包括AD和ADD，其轉(zhuǎn)化得率(%)按下式計算：

式中：cADD、cAD和cP分別為ADD、AD和植物甾醇的濃度，g·L-1；mADD、mAD和mP分別為ADD、AD和植物甾醇的摩爾質(zhì)量，g·mol-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 lzmceG基因克隆

將M.tuberculosisH37Rv的MceG的mkl基因序列與M.neoaurumVKM Ac-1815D全基因組進行比對分析，發(fā)現(xiàn)與定位標簽(locus tag)編號為D174_06445的基因序列相似度最高，為81.7%，其被注釋為ABC transporter ATP-binding protein，位于基因組(GenBank ID：NC_023036)1 335 918～1 336 994位。根據(jù)D174_06445信息設計引物MG-F/MG-R，以M.sp.LZ2全基因組為模板，PCR擴增獲得全長為1 077 bp的lzmceG基因核苷酸片段。

2.2 LzMceG生物信息學分析(表2)

由表2可知，LzMceG氨基酸數(shù)量為358，分子量為39 394.29 Da，等電點為5.68，不穩(wěn)定指數(shù)為47.98，屬于不穩(wěn)定蛋白；不具有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域；主要分布在細胞質(zhì)中，屬于胞內(nèi)酶；CDD數(shù)據(jù)庫比對分析發(fā)現(xiàn)，LzMceG在第5～255位具有1個主結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)儆贏BC轉(zhuǎn)運體MlaF超家族，是一類重要的ATP酶。

表2 LzMceG生物信息學分析預測結(jié)果Tab.2 Prediction results of bioinformatics analysis of LzMceG

為了研究LzMceG的進化關系，將其氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，根據(jù)比對結(jié)果選取21條不同物種的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖1)。結(jié)果表明，MceG廣泛存在于細菌中；M.sp.LZ2中的LzMceG與非致病分枝桿菌MycolicibacteriumfortuitumATCC 6841匯集成一支，然后與MycolicibacteriumsmegmatisMC 2155匯集，再與致病分枝桿菌M.lepraeTN和M.tuberculosisH37Rv形成的分支匯集成一支。因此，MceG在分枝桿菌中有較高的保守性，與其它物種具有一定的差異。

圖1 基于氨基酸序列的LzMceG系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of LzMceG based on amino acid sequences

綜上，可確定LzMceG屬于Mce轉(zhuǎn)運體ATP酶。在M.tuberculosisH37Rv中Mce轉(zhuǎn)運體ATP酶對膽固醇的攝取有顯著的影響[10,16]。因此，推測在M.sp.LZ2中LzMceG對Mce轉(zhuǎn)運體功能的發(fā)揮，特別是甾醇類物質(zhì)的攝入具有重要作用。

2.3 重組菌株M.sp.LZ2/pMV261-lzmG的驗證(圖2)

由圖2可知，PCR目的條帶大小與mceG目的基因大小(約1 040 bp)一致，重組質(zhì)粒pMV261-lzmG雙酶切條帶大小約為4 800 bp和1 040 bp，符合預期。對驗證正確的質(zhì)粒進行測序，結(jié)果表明pMV261-lzmG成功轉(zhuǎn)入M.sp.LZ2中，重組菌株M.sp.LZ2/pMV261-lzmG構(gòu)建成功。

M.DNA marker 1.重組質(zhì)粒pMV261-lzmG雙酶切驗證 2.重組質(zhì)粒pMV261-lzmG的PCR驗證圖2 重組菌株M.sp.LZ2/pMV261-lzmG的驗證 Fig.2 Validation of recombinant strain M.sp.LZ2/pMV261-lzmG

2.4 lzmceG基因轉(zhuǎn)錄水平分析

為進一步研究M.sp.LZ2中LzMceG與AD生產(chǎn)能力的關系，對M.sp.LZ2和M.sp.LZ2/pMV261-lzmG中l(wèi)zmceG基因的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測，結(jié)果如圖3所示。

圖3 M. sp. LZ2和M. sp. LZ2/pMV261-lzmG發(fā)酵不同時間時的lzmceG基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 Transcription levels of gene lzmceG in M. sp. LZ2 and M. sp. LZ2/pMV261-lzmG at different fermentation time

由圖3可知，以M.sp.LZ2中l(wèi)zmceG基因在24 h的轉(zhuǎn)錄水平為基準進行比較，發(fā)現(xiàn)M.sp.LZ2在48 h的lzmceG基因轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，是24 h的3.56倍；雖然在72 h 的lzmceG基因轉(zhuǎn)錄水平有所降低，但依然維持在較高水平，是24 h的1.87倍。M.sp.LZ2/pMV261-lzmG中l(wèi)zmceG基因轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢與M.sp.LZ2的相似。在相同時間點，M.sp.LZ2/pMV261-lzmG中l(wèi)zmceG基因的轉(zhuǎn)錄水平均比M.sp.LZ2有較大幅度升高，在48 h和72 h分別是M.sp.LZ2對應轉(zhuǎn)錄水平的4.02倍和4.58倍。表明，當植物甾醇開始轉(zhuǎn)化為AD時(48 h)，lzmceG基因的轉(zhuǎn)錄水平有所升高，MceG對植物甾醇轉(zhuǎn)化具有重要作用。M.sp.LZ2/pMV261-lzmG中l(wèi)zmceG基因轉(zhuǎn)錄水平的升高也說明MceG過表達菌株構(gòu)建成功。

2.5 MceG過表達對菌株生長的影響(圖4)

由圖4可知，M.sp.LZ2/pMV261-lzmG和M.sp.LZ2具有相似的菌體生長趨勢，但在24 h內(nèi)，M.sp.LZ2/pMV261-lzmG所獲得的生物量略低于M.sp.LZ2。這可能是由于，MceG過表達導致菌株代謝負荷增加。在48 h后，M.sp.LZ2/pMV261-lzmG的生物量始終高于M.sp.LZ2；在168 h時，M.sp.LZ2/pMV261-lzmG所獲得的生物量最高，為4.71 g·L-1，高于M.sp.LZ2的(4.44 g·L-1)。此外，M.sp.LZ2/pMV261-lzmG的最高比生長速率為0.045 h-1，高于M.sp.LZ2的(0.035 h-1)。這可能是由于，MceG的過表達增強了Mce4轉(zhuǎn)運體系的能量供給，從而提高了植物甾醇的轉(zhuǎn)運能力。植物甾醇被轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)后，經(jīng)甾醇側(cè)鏈降解途徑代謝，除會生成3分子NADH和2分子FADH2外，還會生成3分子丙酰輔酶A和1分子乙酰輔酶A；這些含有高能硫酯鍵的輔酶A類物質(zhì)經(jīng)代謝后會生成18分子NADH和7分子FADH2。如果所產(chǎn)生的還原型輔酶全部經(jīng)呼吸鏈用以ATP的生成，則1分子β-谷甾醇代謝為1分子AD，最多可生成80分子ATP[17-18]。因此，菌株攝取植物甾醇能力的增強會增加ATP的生成量，為菌株的生長提供更多的能量，有利于菌株的生長。

圖4 MceG過表達對菌株生長的影響Fig.4 Effect of MceG over-expression on growth of strain

2.6 LzMceG過表達對菌株葡萄糖消耗和AD生產(chǎn)能力的影響

在AD生產(chǎn)中，如果以植物甾醇為單一碳源將會大大延長菌株生長的延滯期，生產(chǎn)效率極低?，F(xiàn)普遍采用葡萄糖和植物甾醇的雙底物發(fā)酵模式來解決這一問題。LzMceG過表達有利于植物甾醇的轉(zhuǎn)運，可能會對菌株葡萄糖消耗和AD生產(chǎn)能力產(chǎn)生影響。對M.sp.LZ2和M.sp.LZ2/pMV261-lzmG轉(zhuǎn)化過程中的葡萄糖消耗和AD生產(chǎn)能力進行連續(xù)監(jiān)測，結(jié)果如圖5所示。

圖5 LzMceG過表達對菌株葡萄糖消耗和AD生產(chǎn)能力的影響Fig.5 Effect of LzMceG over-expression on glucose consumption and AD production capacity of strain

由圖5可知，在72 h前，M.sp.LZ2/pMV261-lzmG的葡萄糖消耗量低于M.sp.LZ2的；72 h后，M.sp.LZ2/pMV261-lzmG的葡萄糖消耗量高于M.sp.LZ2的。在植物甾醇轉(zhuǎn)化能力方面，M.sp.LZ2/pMV261-lzmG的植物甾醇轉(zhuǎn)化得率始終高于M.sp.LZ2的；特別是在72 h后，M.sp.LZ2/pMV261-lzmG的植物甾醇轉(zhuǎn)化得率明顯高于M.sp.LZ2的；M.sp.LZ2/pMV261-lzmG的最高植物甾醇轉(zhuǎn)化得率為81.32%，比M.sp.LZ2(76.69%)高4.63%。這可能是由于，48 h前，植物甾醇攝入的增加降低了葡萄糖的消耗；48 h后，植物甾醇的代謝增強，需要轉(zhuǎn)錄表達大量甾醇側(cè)鏈降解酶，菌株對物質(zhì)和能量的需求加速了葡萄糖的消耗。LzMceG過表達最有益的效果就是提升植物甾醇的轉(zhuǎn)運能力，從而提高M.sp.LZ2的AD生產(chǎn)能力。

3 結(jié)論

以M.sp.LZ2基因組為模板，獲取lzmceG基因全長序列，生物信息學分析結(jié)果表明，LzMceG分子量為39 394.29 Da，不具有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域；胞內(nèi)酶結(jié)構(gòu)域分析表明，MceG是一種ATP酶，屬于ABC轉(zhuǎn)運體MlaF超家族；系統(tǒng)發(fā)育分析表明，MceG在分枝桿菌中有較高的保守性。轉(zhuǎn)錄水平分析表明，MceG能夠響應植物甾醇的代謝，對植物甾醇轉(zhuǎn)化具有重要作用。利用表達型質(zhì)粒pMV261構(gòu)建LzMceG過表達菌株M.sp.LZ2/pMV261-lzmG，與原始菌株M.sp.LZ2相比，重組菌株具有較高的生物量(4.71 g·L-1)和比生長速率(0.045 h-1)。表明，LzMceG的過表達增強了Mce4轉(zhuǎn)運體系的能量供給，提高了植物甾醇的轉(zhuǎn)化能力。菌株攝取植物甾醇能力的增強會增加ATP的生成量，為菌株的生長提供更多的能量，有利于菌株的生長。植物甾醇轉(zhuǎn)化得率分析結(jié)果表明，M.sp.LZ2/pMV261-lzmG的最高轉(zhuǎn)化得率(81.32%)比M.sp.LZ2高。因此，LzMceG在M.sp.LZ2轉(zhuǎn)化甾醇的過程中具有重要作用，過表達LzMceG對植物甾醇的轉(zhuǎn)化具有積極作用。