張偉強(qiáng) 王鳳琴 姚文娟 吳冬梅 仝志超 張婉琳 于 婧

乳腺癌是致癌因子作用于乳腺上皮細(xì)胞，使其發(fā)生增殖失控進(jìn)而惡變的一種病理變化[1]。即使近年來我國(guó)乳腺癌篩查率不斷增加，但部分患者就診時(shí)即為局部晚期乳腺癌，極難通過手術(shù)切除治療[2]，大多采取新輔助化療。新輔助化療通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、清除腫瘤細(xì)胞，從而縮小腫瘤體積，降低腫瘤分期、分級(jí)[3，4]。但新輔助化療前后乳腺癌殘余腫瘤組織的評(píng)估研究仍不明確，尋找有效的殘余腫瘤組織標(biāo)志物作為新輔助化療療效及評(píng)判預(yù)后的指標(biāo)十分重要。

增殖指數(shù)Ki-67被作為是評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞增殖力和侵襲力的重要指標(biāo)，絲氨酸-蘇氨酸激酶受體相關(guān)蛋白(STRAP)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有多種作用[5]，最新的研究[6]提示Ki-67及STRAP在胃癌、肺癌等術(shù)后評(píng)估具有重要提示作用，但在乳腺癌臨床診斷和治療中的價(jià)值仍有待進(jìn)一步研究。故而，本研究嘗試探討STRAP、增殖指數(shù)Ki-67表達(dá)在乳腺癌新輔助化療后殘余腫瘤組織中的評(píng)估價(jià)值，以期為乳腺癌臨床診斷和治療提供可靠的參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象和分組

選取2020-01-2021-05在本院就診的乳腺癌患者100例(乳腺癌組)，4-8個(gè)周期新輔助化療后，根據(jù)Miller-Payne[7]病理評(píng)價(jià)系統(tǒng)，將乳腺癌組患者分為病理完全緩解組(qCR組)患者21例，非病理完全緩解組(qCR組)患者79例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女性患者；(2)符合TNM分期中的ⅡB-Ⅲ期[8]；(3)在本院接受新輔助化療，且化療后接受局部手術(shù)治療；(4)患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有心、肝、腎等重要臟器疾?。?2)合并有其它系統(tǒng)惡性腫瘤；(3)非初治患者。

同時(shí)選取乳腺良性病變患者50例(乳腺良性病變組)，包括乳腺纖維腺瘤23例，乳腺囊性增生21例，導(dǎo)管囊性擴(kuò)張6例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女性患者；(2)經(jīng)病理學(xué)確診；(3)在本院接受手術(shù)治療；(4)患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有心、肝等重要臟器疾病。

乳腺癌和乳腺良性病變患者臨床一般資料比較見表1，組間各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本次研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)KYLL-2020-018)。

表1 乳腺癌和乳腺良性病變患者臨床一般資料比較

1.2 治療方法

所有乳腺通過前哨淋巴結(jié)活檢或穿刺確定有無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移?；煼桨妇走x蒽環(huán)類和(或)紫杉醇為主的新輔助化療，且至少完成4個(gè)周期。每2個(gè)化療周期后行MRI檢測(cè)評(píng)價(jià)治療效果，根據(jù)文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)確定是否化療成功[9]。若臨床評(píng)定為疾病進(jìn)展(PD)或4個(gè)化療周期后評(píng)定為疾病穩(wěn)定(SD)則更換化療方案。完成4-8周期化療后根據(jù)具體情況制定手術(shù)方案。根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果及療效評(píng)價(jià)制定后續(xù)治療方案(根據(jù)乳腺癌診療規(guī)范(2011年版))[10]。

1.3 檢查方法

取化療前腫瘤組織，常規(guī)處理后保存，以備免疫組化檢測(cè)。

1.3.1 STRAP免疫組化法： 60℃的恒溫器中烘烤30min后使用不同梯度二甲苯、乙醇、H2O脫蠟水化，室溫下封閉10min；抗原修復(fù)，微波爐中加熱0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖溶液(pH6.0)直至沸騰，將組織切片放入檸檬酸鈉緩沖溶液20min，自然冷卻至室溫后放入蒸餾水中浸泡10min，山羊血清封閉lh后吸出血清，加入相應(yīng)的STRAP一抗(兔抗人單抗，1∶100) 4℃孵育24h；使用Tris-HCl于TBST中洗滌3次，每次5min，然后加入STRAP二抗(鼠抗兔單抗)孵育1h，TBST洗滌3次，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進(jìn)行顯色，直到變?yōu)闇\黃色，放入蒸餾水終止反應(yīng)；用蘇木精染色，脫水并固定玻片，滴加30%中性樹膠，用蓋玻片固定玻片，根據(jù)染色結(jié)果判定陽性。STRAP以細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色為陽性細(xì)胞，根據(jù)染色強(qiáng)度(無染色為0分，淺棕色為1分，棕色為2分，深棕色為3分)和陽性細(xì)胞比例(1%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，>76%為4分)之和，分?jǐn)?shù)≥3分為陽性表達(dá)。

1.3.2 Ki-67免疫組化：采用PV-6000二步法，Ki-67核抗原及PV-6000試劑盒均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；4%甲醛溶液固定組織后石蠟包埋，4μm連續(xù)切片；組織切片脫蠟、水化；微波修復(fù)20min；3%H2O2孵育5min，PBS沖洗；滴加一抗，4℃冰箱過夜，PBS沖洗，2min×3次；滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育20min，PBS沖洗，2min×3次；DAB溶液顯色；蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、封片。用已知陽性切片作陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。Ki-67以細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色為陽性細(xì)胞，選取細(xì)胞密集區(qū)觀察計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞的比例作為增殖指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌和乳腺良性病變組織Ki-67、STRAP表達(dá)比較

乳腺組織Ki-67和STRAP免疫組化染色陽性圖片見圖1。乳腺癌組組織Ki-67和STRAP陽性表達(dá)率明顯高于乳腺良性病變組組織(P<0.01)。見表2。

Ki-67陽性表達(dá) STRAP陽性表達(dá)

表2 兩組患者病變組織Ki-67、STRAP表達(dá)比較

表3 Ki-67、STRAP表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征比較

2.2 乳腺癌不同臨床病理特征患者Ki-67、STRAP表達(dá)比較

不同年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙、病理類型、腫瘤直徑患者病變組織Ki-67比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙、病理類型、分化程度患者病變組織STRAP比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

TNM分期Ⅲ期、中低分化乳腺癌組織Ki-67明顯高于ⅡB期、高分化組織(P<0.05或P<0.01)；腫瘤直徑≥5cm、TNM分期Ⅲ期乳腺癌組織STRAP陽性表達(dá)率明顯高于腫瘤直徑<5cm、ⅡB期組織(P<0.01)。見表3。

2.3 qCR組和非qCR組乳腺癌患者病變組織Ki-67、STRAP表達(dá)比較

qCR組患者Ki-67和STRAP陽性表達(dá)率明顯低于非qCR組患者(P<0.01)，見表4。

表4 兩組乳腺癌患者病變組織Ki-67、STRAP表達(dá)比較

2.4 Ki-67聯(lián)合STRAP對(duì)非qCR的預(yù)測(cè)價(jià)值

Ki-67聯(lián)合STRAP預(yù)測(cè)非qCR的ROC曲線下面積為0.819，明顯高于Ki-67、STRAP單獨(dú)預(yù)測(cè)的0.711和0.632(P<0.01)，靈敏度和特異度分別為84.50%和87.00%，見圖2和表5。

圖2 Ki-67、STRAP對(duì)非qCR預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC曲線分析

表5 Ki-67、STRAP對(duì)非qCR的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

3 討 論

Ki-67抗原是目前公認(rèn)的一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的蛋白，其表達(dá)與細(xì)胞周期密切相關(guān)，Ki-67說明乳腺癌細(xì)胞增殖敏感性，Ki-67陽性表達(dá)率反映了腫瘤細(xì)胞快速增殖、高侵襲、轉(zhuǎn)移率，其陽性表達(dá)率越高，腫瘤細(xì)胞增殖越快[11，12]。有研究發(fā)現(xiàn)[13]，Ki-67不表達(dá)于DNA修復(fù)狀態(tài)的細(xì)胞，能更好地顯示與腫瘤增殖之間的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織Ki-67陽性表達(dá)率明顯高于乳腺良性病變組織，與以往觀點(diǎn)相符。其機(jī)制可能是Ki-67促進(jìn)微血管形成，導(dǎo)致乳腺癌腫瘤快速增長(zhǎng)，考慮降低其表達(dá)會(huì)抑制腫瘤增殖，因此可將Ki-67表達(dá)降低作為化療后病理緩解程度的指標(biāo)。

既往研究指出STRAP在癌細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，其表達(dá)水平與癌細(xì)胞的分化水平相關(guān)， STRAP的異常表達(dá)導(dǎo)致惡性腫瘤的產(chǎn)生[14]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織STRAP陽性表達(dá)率明顯高于乳腺良性病變組織，佐證了上述觀點(diǎn),可能與該蛋白普遍存在于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中，在細(xì)胞核中發(fā)揮其生物學(xué)特性有關(guān)。

本研究顯示腫瘤直徑≥5cm、TNM分期Ⅲ期乳腺癌組織STRAP陽性表達(dá)率明顯高于腫瘤直徑<5cm、ⅡB期組織(P<0.05)。提示sTRAP可作乳腺癌分化程度的標(biāo)志物，其表達(dá)水平對(duì)于惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展十分重要[15]。本研究創(chuàng)新性提出以STRAP作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，為乳腺癌的臨床診斷提供可靠的理論依據(jù)。Ki-67與腫瘤細(xì)胞快速增殖有關(guān), 本研究發(fā)現(xiàn)TNM分期Ⅲ期、中低分化乳腺癌組織Ki-67明顯高于ⅡB期，高分化組織(P<0.05)；Ki-67增殖指數(shù)是乳腺癌分子分型的標(biāo)志物，故檢測(cè)殘留Ki-67水平在患者后續(xù)治療計(jì)劃及預(yù)后評(píng)估中顯得十分重要[16]。

既往研究發(fā)現(xiàn)新輔助化療后Ki-67水平與癌細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān)[17，18]。本研究顯示，qCR患者Ki-67陽性表達(dá)率明顯低于非qCR患者，提示新輔助化療效果好的患者Ki-67陽性表達(dá)率較低，其呈低表達(dá)抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。STRAP促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖與分化，在多種癌變組織中高表達(dá)[19]，本研究發(fā)現(xiàn)qCR患者STRAP陽性表達(dá)率明顯低于非qCR患者(P<0.05)，說明STRAP水平與新輔助化療效果有關(guān)。有資料顯示[20]Ki-67不同程度的表達(dá)是影響乳腺癌預(yù)后最主要因素，臨床上乳腺癌化療期間可將Ki-67作為判斷其治療效果和預(yù)后的重要標(biāo)志物。同時(shí)在新輔助化療領(lǐng)域，涉及Ki-67的研究也層出不窮，其對(duì)治療效果的預(yù)測(cè)作用逐漸上升為研究重點(diǎn)領(lǐng)域。

本研究在以往研究基礎(chǔ)上聯(lián)合檢測(cè)了STRAP水平，旨探討新輔助化療后腫瘤殘余的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示Ki-67聯(lián)合STRAP預(yù)測(cè)非qCR的ROC曲線下面積明顯高于Ki-67、STRAP單獨(dú)預(yù)測(cè)，說明二者均能夠反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性。 Ki-67一般出現(xiàn)在細(xì)胞分裂周期的G1、S、G2和M期，如若在病理報(bào)告中Ki-67指標(biāo)表達(dá)較高，也就意味腫瘤細(xì)胞處于增殖較快階段，能準(zhǔn)確反映細(xì)胞增殖狀態(tài)； STRAP能夠調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，是一種較為理想的細(xì)胞增殖標(biāo)志物,在判斷腫瘤細(xì)胞增殖活性、指導(dǎo)臨床治療及判斷化療療效中十分重要。

綜上所述，乳腺癌患者STRAP、Ki-67表達(dá)明顯增強(qiáng)，與TNM分期、腫瘤直徑、分化程度有一定關(guān)系；STRAP聯(lián)合Ki-67預(yù)測(cè)新輔助化療后腫瘤殘余方面有一定應(yīng)用價(jià)值。本研究樣本量不足，下一步應(yīng)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更深入、全面的研究。

?

本文第一作者簡(jiǎn)介：

張偉強(qiáng)(1980-)，男，漢族，主管技師，研究方向：免疫組織化學(xué)病理診斷